p62 基因缺失對人脂肪間充質干細胞成脂的促進作用

曾瑞霞,張軼博

（1.錦州醫科大學基礎醫學院解剖學教研室，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫科大學基礎醫學院病原生物學教研室，遼寧 錦州 121001）

肥胖發生的根本原因是脂肪細胞體積變大和數量增多，而后者很大程度上是由于脂肪分化異常所致［1-3］。脂肪間充質干細胞（adipose-derived stromal cells，ADSCs）作為脂肪細胞形成的源頭，其增殖能力和分化潛能直接決定了成熟脂肪細胞的數量，影響脂肪組織的結構與構成。p62 是自噬-溶酶體系統中重要的中介分子［4-5］，p62 基因敲除的小鼠發生肥胖和胰島素抵抗，白色脂肪組織中脂肪積累增加，脂肪內脂質的合成增加［6］。自噬相關基因7（autophagy-related gene 7，Atg7）敲除的小鼠以及Atg7 缺失的小鼠3T3-L1 前脂肪細胞的研究顯示：脂肪組織中總脂肪堆積量和脂滴數量減少，且脂滴體積縮小，小鼠3T3-L1 前脂肪細胞分化的成熟脂肪細胞內脂滴數量減少，表明自噬被抑制后可降低甘油三酯積累，抑制脂肪細胞分化。線粒體自噬是一種選擇性自噬，即自噬泡膜上有識別受損線粒體的特異受體，并對其針對性地進行降解，這對于維持線粒體正常的數量和功能非常重要。目前，關于脂肪分化的研究多以小鼠3T3-L1前脂肪細胞為模型，本研究選用人脂肪間充質干細胞（human adipose-derived stromal cells，hADSCs）作為研究對象進行脂肪分化研究，該細胞與小鼠3T3-L1 細胞比較更接近人的生物學狀態，對疾病的預防和治療更具有指導意義。肥胖和高脂飲食有密切關聯［7-8］，而油酸（oleic acid，OA）是動物油和植物油中常見的游離脂肪酸，也是血液游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）含量最多的成分，將其替代3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）進行成脂誘導，可在一定程度上模擬人體的生理作用模式。p62 是否通過調節脂肪細胞的分化而影響肥胖的發生尚未見文獻報道，故本研究構建p62 shRNA 慢病毒載體，探討p62 基因缺失對hADSCs 成脂能力的影響以及與自噬之間的關系。脂肪分化過程中伴隨著脂滴的形成及甘油三酯的合成，而線粒體是脂肪酸氧化的核心場所，因此在明確自噬在hADSCs 成脂過程中的基本作用后，進一步探討線粒體自噬與p62 基因在hADSCs 成脂中的作用及關系，為更深入闡明人脂肪分化的分子機制和尋找新藥的作用靶點提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象、主要試劑和儀器脂肪組織取自3 例大腿皮下脂肪抽吸術者（錦州醫科大學附屬第三醫院整形外科），供者均為25～35 歲的健康女性，并對實驗知情同意。單丹磺酰戊二胺（monodansylcadaverine，MDC）（大連寶生物工程有限公司），細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（美國Invitrogen 公司），Mitotraker Red 探針（美國Invitrogen 公司），一抗兔抗人β-actin、微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、CCAAT 增強子結合蛋白 α（CCAAT/enhancer binding protein alpha，CEBPα）、p62 單克隆抗體和羊抗兔IgGHRP 二抗（美國Sigma 公司）。DP71 型正置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），PRISM 7300 型實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）。

1.2 p62 基因的shRNA 引物合成和慢病毒載體構建根據GenBank 公布的人p62 基因核苷酸序列（NM_001142299），人p62 基因特異性shRNA 靶序列（5'-GCAGATGAGGAAGATCGCCTT-3'）的設計、合成以及慢病毒載體的構建由上海吉凱基因化學技術有限公司完成。

1.3 hADSCs 的分離和培養將皮下脂肪抽吸液裝入50 mL 離心管，0.1%的Ⅰ型膠原酶進行消化，于37℃水浴箱作用1 h；加入等體積的完全培養基終止消化，1 500 r·min－1離心10 min，棄上清，留沉淀；將沉淀使用7 mL 低糖DMEM 進行吹打混勻，200 目網過濾，收集濾液；1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，留沉淀；L-DMEM 吹打混勻沉淀，將其移入75cm2的培養瓶中，放入5% CO2、37℃恒溫細胞培養箱中進行常規培養。

1.4 OA誘導hADSCs的脂肪分化采用80 μmol·L－1OA、10 mg·L－1胰島素和1 μmol·L－1地塞米松在hADSCs 成脂的全程進行持續誘導10 d，鏡下觀察成脂情況。

1.5 CCK-8 實驗繪制hADSCs 生長曲線將對照組和p62 基因缺失組hADSCs 接種于96孔細胞培養板中，每孔1×103個細胞，并于接種后0～7d檢測細胞活性，每孔加入10μLCCK-8溶液，于37℃、5% CO2孵箱中繼續培養2 h，使用分光光度計在450 nm 波長處測定吸光度（A）值，以A值為縱坐標，培養天數（d）為橫坐標繪制細胞生長曲線。

1.6 Western blotting法檢測hADSCs中p62、C/EBPα 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平取第3 代對數生長期hADSCs 接種于6孔水平板中，待細胞達50%融合后加入重組慢病毒感染。24h后PBS緩沖液沖洗3次，待細胞繼續生長2d，誘導10d，進行尼羅紅染色。于接種后10d采用Western blotting法檢測hADSCs中p62、C/EBPα和自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達水平。

1.7 MDC 熒光染色檢測自噬囊泡將P3 代hADSCs 接種到放有蓋玻片的24 孔細胞培養板上進行成脂誘導，3d后進行染色觀察。將細胞用PBS 緩沖液清洗3次后，換為含MDC的培養基37℃孵育10min，PBS緩沖液洗滌2次，取出蓋玻片，用紫外光激發，于倒置熒光顯微鏡下觀察和攝片。

1.8 Mitotracker Red 熒光共定位檢測hADSCs 中線粒體自噬活性將P3 代hADSCs 接種到6 孔細胞培養板上進行成脂誘導，3d后加入200 nmol·L－1的MitotrackerRed進行染色15 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，4%多聚甲醛固定15 min。加入2 mL 0.1%Trition X-100 作用20 min；10%山羊血清封閉30 min；加入兔抗人LC3多克隆抗體，4℃過夜；加入Alexa Fluor 鼠抗兔IgG 二抗，避光，37℃孵育1 h。將細胞置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，計數各組含脂滴細胞數。

1.9 統計學分析采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。各組hADSCs細胞增殖活性，MDC染色陽性細胞數，各組hADSCs中p62、C/EBPα和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hADSCs 的形態表現分離培養的hADSCs接種24h后可見細胞貼壁，呈短梭形。接種4d后，細胞開始增殖，并充分伸展，呈多角形或梭形。傳代后細胞生長速度加快，呈漩渦狀排列（圖1）。

2.2 光鏡下觀察OA 誘導hADSCs 成脂后脂滴的形成選取80 μmol·L－1OA 聯合地塞米松和胰島素對hADSCs 進行成脂誘導10 d，光鏡下觀察到細胞內有大量脂滴形成（圖2）。

2.3 hADSCs 生長曲線將慢病毒shp62 轉染細胞24 h 后，更換培養液繼續培養，結果顯示：細胞形態未發生明顯變化。采用CCK-8 比色法繪制生長曲線（圖3），結果顯示：在培養7 d 內，生長曲線呈“S”形，但p62 基因缺失組生長曲線較低，細胞增殖緩慢；在培養5 和6 d 后p62 基因缺失組細胞增殖活性較對照組明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。

圖3 2 組hADSCs 的生長曲線Fig.3 Growth curves of hADSCs in two groups

2.4 尼羅紅染色結果和hADSCs 中C/EBPα 蛋白表達水平與對照組比較，p62 基因缺失組hADSCs 誘導脂肪分化至第3 天時，細胞形態變圓，細胞內已出現微小的脂滴，而對照組誘導第5 天才有脂滴出現；誘導分化至8～10 d，脂滴更豐富，細胞進一步變大變圓，尼羅紅染色顯示有豐富的脂滴，尼羅紅脂滴染色陽性細胞數增多（圖4）。Western blotting 法檢測結果顯示：p62基因缺失組C/EBPα 蛋白表達水平（1.40±0.10）較對照組（0.80±0.10）明顯升高（P＜0.01）（圖5）。

圖5 Western blotting 法檢測2組hADSCs中C/EBPα 蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of C/EBPα protein in hADSCs in two groups detected by Western blotting method

2.5 MDC 染色結果和hADSCs 中LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白表達水平MDC 染色結果顯示：對照組MDC熒光呈彌散分布，p62 基因缺失組為點狀聚集，胞漿內熒光顆粒顯著增多，熒光強度增加（圖6），MDC 染色陽性細胞數（26.13±1.24）較對照組（16.34±1.42）明顯增加（P＜0.05）。Western blotting 法檢測結果顯示： p62 基因缺失組hADSCs 中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平（0.80±0.10）較對照組（0.33±0.15）明顯升高（P＜0.01）（圖7）。

圖7 Western blotting 法檢測2 組 hADSCs 中 LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達電泳圖Fig.7 Electrophoregram of expressions of LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰproteins in hADSCs in two groups detected by Western blotting method

2.6 Mitotracker Red 熒光共定位檢測hADSCs 中線粒體自噬活性與對照組比較，在分化3 d，p62基因缺失hADSCs 中LC3 的點狀化和顆粒化增多，與線粒體的共定位現象增加（圖8）。在分化10 d，光鏡下計數含脂滴細胞數（圖9），對照組為（26.67±1.53）個，p62 基因缺失組為（87.33±2.52）個，環孢菌素 A（cyclsporin A，CsA）組為（14.67±2.52）個，p62 基因缺失+CsA 組為（32.33±2.51）個。當p62 基因缺失引起線粒體自噬的增加被CsA 抑制后，其促進成脂的作用也被抑制，降低到接近對照組的水平。

3 討論

p62 基因敲除小鼠出現肥胖和胰島素抵抗，基礎脂水解變慢，并在其脂肪組織中發現脂滴數量增多，甘油三酯合成增加，脂肪細胞體積增大。本研究將慢病毒shp62 轉染至hADSCs 中，內源p62 基因沉默后，再進行成脂分化，結果顯示：尼羅紅染色陽性細胞數明顯增多，調節成脂的關鍵分子C/EBPα 的蛋白表達水平明顯升高，表明p62 基因缺失明顯增強了hADSCs 的成脂能力。干細胞的自我復制能力，也是干細胞維持“穩態”的一種體現，而p62 基因缺失降低hADSCs 的自我復制能力，在一定程度上表明干細胞維持穩態的能力下降，可能趨向分化。

鑒于p62 作為自噬發生的重要中介物質，以及自噬在肥胖中的研究，本研究探討p62 基因與自噬在hADSCs 成脂中的相互作用，MDC 染色及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白檢測結果顯示：p62 基因的缺失在促進成脂過程中激活了自噬。研究［4］顯示：如果p62 基因缺失，與p62 基因參與介導有關的自噬將降低；而本研究結果則顯示：hADSCs 中p62 基因缺失導致自噬活性增強，與報道［4］結果相反，推測其可能原因：由于p62 基因也可介導泛素蛋白酶體系統（UPS）對小分子蛋白的降解，因此p62 基因缺失后，很多由p62 基因介導的小分子物質不能被UPS 清除，在細胞內大量聚集，后者可通過其他中介分子形成復合體，進而通過自噬進行降解，因此細胞的自噬活性增強。

研究［9-10］顯示：線粒體在維持干細胞自我更新和定向分化中具有重要作用，當干細胞走向分化時，線粒體逐漸“成熟”，數量增加，功能增強。成脂過程中線粒體增加可能與以下2 個因素有關：①細胞分化過程需要線粒體提供足夠的ATP 以保證細胞發生重建；②分化后成熟的脂肪細胞內有大量脂滴形成，線粒體的數量和功能對于脂滴及甘油三酯的合成有重要作用。Mitotracker Red 探針對于線粒體的染色是親脂的，不依賴于線粒體膜電位［11-12］。通過Mitotracker Red 探針標記線粒體（紅色）和LC3 免疫熒光標記自噬體（綠色）不僅可以分別觀察自噬體和線粒體［13-14］，也可以在共聚焦顯微鏡下觀察二者的共定位，以確定線粒體自噬的發生［15-17］。本研究中Mitotracker Red 探針標記檢測結果顯示：p62 基因缺失細胞中LC3 的點狀化和顆粒化增多，并觀察到與線粒體的共定位現象增加，表明二者的復合體增多，提示p62 基因缺失在hADSCs 成脂中促進線粒體自噬。本研究使用CsA抑制線粒體自噬，當p62 基因缺失引起線粒體自噬的增加被CsA 抑制后（CsA+p62 基因缺失），其促進成脂的作用也被抑制，表明p62 基因缺失導致的成脂增加與線粒體自噬作用增強有關。關于p62 基因缺失如何會增強線粒體自噬，可能與p62 基因在機體中對線粒體作用的雙面性有關：p62 基因既可作為中介分子介導線粒體自噬發生，也可穩定線粒體的形態使其免受損傷而抑制線粒體自噬的發生［18-20］。

綜上所述，在hADSCs 脂肪分化過程中，p62基因缺失不僅導致自噬流增加，而且使得自噬流的分布不均：線粒體導向的自噬流增多，保證了hADSCs 分化中所需大量線粒體的更新，使分化進一步延續，脂質合成逐漸增加，最終使得成脂增加。