含纈酪肽蛋白促進單鏈RNA 和雙鏈DNA 病毒復制或釋放機制的研究進展

徐娜,桓晨,鄭柏松

（吉林大學第一醫(yī)院艾滋病與病毒研究所，吉林 長春 130021）

含纈酪肽蛋白（valosin-containing protein，VCP）又名P97，屬三磷酸腺苷酸酶超家族（ATPases associated with various cellular activities，AAA）成員之一。自1982 年首次從酵母中分離后［1］，VCP先后在多種哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)［2］。作為一種普遍存在于各種哺乳動物細胞質中的蛋白，VCP 在結構上為一種環(huán)狀同源六聚體復合物［3］。每個單體包含4 個結構域：1 個可移動的N 端結構域、2 個保守的AAA 結構域（稱為D1 和D2）和1 個無序的C 端尾部結構域［4-5］。每個AAA 結構域都包含保守的核苷酸結合基序和水解基序以及有效水解所必需的第二同源區(qū)域［6-7］。以往研究［8-10］表明：VCP 的核心功能是依賴于其ATPase 活性的泛素化蛋白水解作用，這一功能使得VCP 不僅能夠參與細胞內核酸重建、內質網(wǎng)和線粒體相關蛋白降解［11-12］、細胞周期調控［13-14］、核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）活化［15］、膜融合和囊泡運輸［16］等重要細胞活動，還具有抗細胞凋亡和促進細胞增殖及浸潤等作用。

近年來，圍繞VCP 的功能研究已經(jīng)證實VCP與蛋白穩(wěn)態(tài)失調相關疾病及癌癥有關聯(lián)，其中包括亨廷頓舞蹈病（Huntington’s disease，HD）［17］、雄激素非依賴性前列腺癌（androgen-independent prostate cancer，AIPC）［18］和多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）［19］等。VCP 能有效殺傷癌細胞，可能是一種廣泛的抗腫瘤因子。隨著研究的深入，VCP 與感染性疾病的聯(lián)系愈加緊密，其作為宿主因子參與病毒相關的感染性疾病的研究已受到廣泛關注。目前，圍繞VCP 研究的綜述主要在2 個方面：一方面是圍繞VCP 介導的蛋白質降解及其機制，包括蛋白酶體降解、內質網(wǎng)相關降解（endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD）和自噬［14］；另一方面是關于VCP參與DNA 復制和染色質動力學等細胞周期的調控和機制研究［13，20］。目前，關于VCP 參與的ERAD 相關的蛋白降解途徑的研究較為深入。盡管VCP 借助蛋白質降解和DNA 調控等功能參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，但未見針對VCP 作為宿主因子在病毒性疾病中的作用及其分子機制方面的報道。現(xiàn)針對近年來報道的VCP 同多種病毒在人體內的復制或釋放的相關研究進行綜述（表1），為病毒感染性疾病的診治提供參考。

1 VCP 參與單股正鏈RNA 病毒的復制

在修飾的宿主細胞內膜上組裝病毒復制酶以形成復制復合物（replication complex，RC）是幾乎所有正鏈RNA 病毒成功復制的標志［21］。VCP 與單鏈RNA 病毒的復制有關聯(lián)，其中包括西尼羅河病毒（West Nile virus，WNV）［22］、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）［23］、脊髓灰質炎病毒（poliovirus，PV）［24］、腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）［25］、冠狀病毒（coronavirus，CoV）［26］、辛德畢斯病毒（Sindbis virus，SINV）［27］和基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）［28］。

1.1 VCP 參與黃病毒科黃病毒屬病毒成員的復制WNV 和HCV 均是黃病毒科黃病毒屬的成員，屬于有包膜結構的單股正鏈RNA 病毒［22-23］。WNV主要導致西尼羅河腦炎，HCV 主要引起丙型肝炎。PHONGPHAEW 等［29］研究發(fā)現(xiàn)：在HeLa 細胞中使用VCP 抑制劑或siRNA 抑制內源性VCP 表達后，WNV 病毒感染能力及RNA 表達水平明顯降低，表明VCP 可能在WNV 病毒生命周期的吸附或進入的早期步驟中起作用。該研究通過構建WNV 病毒樣顆粒和基于WNV-DNA 的復制子，證明VCP 參與合成新的WNV 病毒基因組并介導WNV 病毒復制［29］。研究［30］發(fā)現(xiàn)：在Huh7.5 細胞中利用分子生物學技術敲除VCP 或加入VCP 生理抑制劑EerI 和NMS-873 后，能夠降低HCV 病毒的復制水平。在此過程中，VCP 通過與HCV 病毒的一種無酶活性的多功能非結構蛋白NS5A DI 相互作用，達到參與HCV 病毒復制的目的。VCP 表達受抑制后，促使HCV NS5A 聚集并減少NS5A 的高度磷酸化，影響HCV 病毒復制酶的組裝，進而影響復制復合物的形成［30-31］，最終影響HCV 病毒的復制。綜上所述，在HCV 復制過程中，VCP 發(fā)揮解聚作用，利用腺苷三磷酸酶（ATPase）酶活性（氨基酸位點：241～647 位）防止HCV NS5A 聚集，幫助HCV 病毒復制。

1.2 VCP 參與小核糖核酸病毒科腸道病毒屬病毒成員的復制PV 和EV71 同屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬成員，是無包膜結構的單股正鏈RNA 病毒［24-25］。PV 主要引起脊髓灰質炎，EV71是導致手足口病的重要病原體之一。ARITA 等［24］針對膜轉運基因對PV 病毒復制所需的宿主因子進行小干擾RNA（siRNA）篩選，發(fā)現(xiàn)VCP 與PV病毒復制有關。為了確定VCP 與PV 病毒復制相關的主要活性位點，研究者對VCP ATPase 活性位點進行點突變［32］，獲得K524A 失活突變體和R191Q及A232E 活性增強突變體。通過在沉默VCP 的HEK293T 細胞中過表達野生型VCP 和2 種突變體VCP［32］，結果顯示：與轉染了野生型和活性增強突變體VCP 的細胞比較，PV 病毒在轉染K524A失活突變體細胞中的復制能力明顯降低，表明VCP 的ATPase 活性對于維持PV 病毒的復制至關重要。WU 等［33］首次針對EV71 病毒易感細胞——橫紋肌肉瘤細胞（RD）中21 121 個人類全基因組siRNA 文庫進行了基于免疫熒光的表型篩選，鑒定出促進 EV71 病毒復制的因子（host susceptibility factors，HSFs，又稱宿主易感性因子）和抑制EV71 病毒復制的因子（host resistance factors，HRFs，又稱宿主抗性因子）；最終發(fā)現(xiàn)可能參與EV71 病毒復制所涉及的256 個宿主因子，其中宿主抗性因子包含細胞周期調節(jié)劑極光激酶B（aurora kinase B，AURKB）和細胞周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6），而EV71 可能通過誘導CDK6 的出核而對EV71 病毒的復制進行調節(jié)。另外，ERAD 成分N-聚糖酶1（N-glycanase 1，NGLY1）和VCP 被證明是EV71宿主易感因子，能夠在特定的細胞周期階段促進EV71 的復制。WANG 等［34］通過探討EV71 病毒感染過程中ERAD 底物的變化發(fā)現(xiàn)：EV71 病毒感染能夠通過多重位點——HES 相關抑制蛋白（hes-related repressor protein，Herp）、羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶降解蛋白1（Hmg-Co A reductase degradation 1，Hrd1）、E2 泛素結合酶（E2 ubiquitin-conjugating enzymes，Ubc6e）、VCP 相關膜蛋白（VCP-interacting membrane protein，VIMP）和泛素調節(jié)X 結構域的膜蛋白8（ubiquitin regulatory X domain-containing protein 8，UBXD8）將ERAD 底物錨定在內質網(wǎng)上，VCP 能夠促進EV71 病毒的復制。其中，EV71 3C 蛋白能夠在Q219G、Q260S 和Q273G 3 個位點［35］處切割E2泛素結合酶Ubc6e，而EV71 2A 蛋白則抑制Herp和VIMP 的合成，導致ERAD 途徑受到抑制。其中，VIMP 是一種與VCP 具有相互作用的膜蛋白［36］，能夠招募VCP 和其他輔助因子至內質網(wǎng)［37］。免疫共沉淀實驗［34］表明：VCP ATPase 活性區(qū)域能夠與EV71 病毒相結合，而且VCP 能與EV71 2C 蛋白在復制復合物中發(fā)生共定位，致使內質網(wǎng)膜發(fā)生重塑，促進EV71 病毒的復制。VCP 并不能作用于腸道病毒屬柯薩奇病毒 B3（coxsackievirus B3，CVB3）的復制［24］，表明VCP對腸道病毒屬病毒的促進作用具有偏好性，有待進一步研究。

1.3 VCP 參與CoV 的復制CoV 是一類有包膜的正鏈RNA 病毒，可在人類和多種哺乳動物中引起呼吸道和腸道疾?。?6］。WONG 等［38］以CoV 家族成員之一的傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）為模型，發(fā)現(xiàn)VCP 在IBV病毒復制早期發(fā)揮作用。

1.4 VCP 參與披膜病毒科甲病毒屬病毒的復制1955 年分離的SINV 和1952 年分離的CHIKV 同屬于披膜病毒科甲病毒屬，是具有囊膜結構的單股正鏈RNA 病毒。VCP 能夠調節(jié)SINV［27］進入受體天然抗性相關的巨噬細胞蛋白2（natural resistanceassociated macrophage protein 2，NRAMP2）的運輸，在果蠅細胞中敲除VCP 后，將改變NRAMP2的運輸途徑導致NRAMP2 被溶酶體降解和SINV病毒的復制受到抑制［27］。VCP 在CHIKV 生命周期中的病毒RNA 復制中起作用［28］，但不影響CHIKVA 病毒的吸附或進入。

2 VCP 促進雙鏈DNA 病毒的復制

盡管VCP 參與多種單鏈RNA 病毒的復制，但截止目前為止VCP 同DNA 病毒相互關系的研究鮮有報道。加州苜蓿多核核型多角體病毒（autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）屬于昆蟲細胞桿狀病毒，是一種雙鏈DNA 病毒。LYUPINA 等［39］發(fā)現(xiàn)：利用藥物NMS-873 抑制VCP 可阻斷桿狀病毒AcMNPV 的感染周期，導致芽狀病毒粒子產(chǎn)生受到抑制，并且VCP 通過其ATPase 活性參與泛素-蛋白酶體途徑，促進AcMNPV 病毒的復制。

人類巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）作為一種感染人類的雙鏈DNA 病毒，是皰疹病毒家族中基因組最大的成員，先天性感染在HCMV 病毒感染中占據(jù)較高比例［40］。HCMV 的早期蛋白質IE1 和IE2 是HCMV 復制的關鍵，能夠平衡激活感染和潛伏感染。LIN 等［41］敲除VCP 后導致IE2 表達丟失，表明VCP 是HCMV 蛋白IE2 表達所必需的。RNAseq 分析［41］顯示：敲除VCP后，IE1 剪接水平增加，IE2 剪接水平相應減少。病毒轉錄的整體分析顯示：盡管IE2 表達丟失，但包括UL112/113 在內的病毒基因的子集表達水平并未降低，表明VCP 敲低引起的IE1 和IE2 水平變化不是病毒復制延遲所導致。免疫熒光實驗研究［41］結果顯示：VCP 與細胞核中的病毒復制區(qū)具有共定位，進一步表明VCP 對于HCMV 的復制具有重要意義。

3 VCP 參與病毒粒子的釋放

除影響病毒復制外，VCP 與病毒粒子釋放相關。裂谷熱病毒（rift valley fever virus，RVFV）屬于布尼亞病毒目白纖病毒科白蛉病毒屬，RVFV病毒是裂谷熱（rift valley fever，RVF）的病原體，RVF 是一種人畜共患病毒，可導致人畜共患?。?2］。BRAHMS 等［43］研究發(fā)現(xiàn)：在分泌途徑中涉及膜重塑功能的VCP 對RVFV 病毒的釋放很重要；Vero 細胞中敲除VCP 后導致RVFV 病毒復制減少，且RVFV 病毒糖蛋白Gn 與高爾基復合體定位減少，而在ER 的積累增加；在用靶向VCP 的siRNA 轉染的細胞中也觀察到RVFV 病毒粒子在細胞內的積累。該研究結果提示：siVCP 后RVFV病毒粒子的組裝發(fā)生在高爾基體中，但在組裝后將其錨定至內質網(wǎng)來阻止病毒粒子釋放。

在關于PV 病毒的研究中，ARITA 等［24］通過在PV 病毒感染的RD 細胞和HEK293T 細胞中進行VCP 與病毒蛋白共定位及相互作用分析發(fā)現(xiàn)：VCP 與PV-2BC/2C 蛋白和3AB/3B 蛋白存在共定位情況，鄰位連接作用（proximity ligation assay，PLA）分析顯示VCP 與2BC 和3AB 蛋白相互作用，但不與2C 蛋白和3A 蛋白相互作用；敲除VCP 后，PV 病毒蛋白表達相應減少。該研究發(fā)現(xiàn)了細胞蛋白分泌與病毒RNA 復制之間的新型聯(lián)系。

表1 VCP 與單鏈RNA 和雙鏈DNA 病毒關系Tab.1 Relationships between VCP and single-stranded RNA and double-stranded DNA viruses

4 總結與展望

目前，VCP 不僅可以通過參與病毒復制體的組裝實現(xiàn)促進病毒基因復制的作用，還可以通過膜重塑功能參與病毒粒子的釋放。VCP 不參與負鏈RNA 病毒水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）的生命活動。目前針對VCP 與單股正鏈RNA 病毒的研究較多，其中VCP 對腸道病毒屬PV 和EV71 均能有效的促進病毒復制，但不影響CVB3 病毒的復制，表明不同腸道病毒的致病機制不同。針對VCP 參與正鏈RNA 病毒W(wǎng)NV、HCV、PV、EV71、CoV、SINV、CHIKV 和RVFV 病毒生命周期的廣譜性，以及對于DNA 病毒AcMNPV、皰疹病毒HCMV 特異的促進作用及依據(jù)VCP 能夠有效調控ERAD 和自噬等相關途徑的特點，將有助于設計新的抗病毒藥物，為感染性疾病的診治提供新的思路。