黃芪注射液對睡眠剝奪大鼠心臟的保護作用及其機制

李偉 ,張海峰,王淼,霍靜,張穎,趙翠

（1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院全科醫(yī)療科，河北 承德 067000；2.解放軍第三〇九醫(yī)院心理醫(yī)學科，北京 100080）

睡眠剝奪是指一段時間內(nèi)完全缺乏或少于最佳睡眠的時間［1］。充足的睡眠是確保機體健康的基礎(chǔ)，睡眠剝奪會導致神經(jīng)功能障礙，免疫功能下降，代謝性疾病、心血管疾病和癌癥等發(fā)生，嚴重者甚至可引起死亡［2］。研究［3］顯示：睡眠剝奪是心血管疾病風險的獨立預測因子，睡眠持續(xù)時間與心臟疾病的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)，主要表現(xiàn)為氧化應(yīng)激損傷和心肌細胞炎癥反應(yīng)。心肌內(nèi)皮細胞損傷促進單核細胞黏附并聚集于細胞內(nèi)膜，誘導細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）等的表達，參與組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展［4］。黃芪是豆科植物黃芪和內(nèi)蒙黃芪干燥根，具有補氣升陽和利水消腫的功效［5］。研究［6］表明：黃芪制劑黃芪注射液有增強機體免疫能力、減少自由基生成和減輕組織炎癥反應(yīng)的活性。目前國內(nèi)已有研究［7］表明：黃芪注射液具有改善生化代謝作用，可通過減少腦組織氧自由基減輕睡眠剝奪對機體的損害。但近年來尚未發(fā)現(xiàn)黃芪注射液對睡眠剝奪大鼠心臟保護作用的相關(guān)研究。本研究采用改良多平臺水環(huán)境法（modified multiple platform water environmental method，MMPWM）建立睡眠剝奪大鼠模型，觀察睡眠剝奪對大鼠心肌氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)指標的影響，探討黃芪注射液對大鼠心肌組織的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和主要儀器健康雄性SD 大鼠40 只，購自河北省實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2018-003。黃芪注射液購自神威藥業(yè)集團有限公司，國藥準字：Z13020999，每毫升含2 g 生藥量；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒購自廣州菲博生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細胞介素 6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒，B 淋巴細胞瘤2（B lymphoblastoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）、ICAM-1、VCAM-1 和Caspase-3 及GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司。BX53 型奧林巴斯光學顯微鏡購于鄭州朋來儀器有限公司，DR700 半自動生化分析儀購于長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司。

1.2 實驗動物分組及動物模型建立40 只SD 大鼠隨機分為對照組、模型組、低和高劑量黃芪注射液組，每組10 只。低和高劑量黃芪注射液組大鼠分別腹腔注射0.2 和0.8 mL·kg－1黃芪注射液，每天給藥1 次，對照組和模型組給予生理鹽水1 mL·100 g－1，連續(xù)給藥2 周。2 周后，采用MMPWM 建立大鼠睡眠剝奪模型［8］。模型組和低及高劑量黃芪注射液大鼠組采用小平臺造模，其原理為：由于平臺（直徑6.5cm，高度8.0cm）較小，若大鼠進入睡眠，會由于全身肌張力下降而導致垂頭觸水并驚醒，多次反復使得睡眠剝奪連續(xù)72 h。對照組采用大平臺，大鼠可自由活動和休息。

1.3 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)表現(xiàn)取大鼠心臟，清洗，采用10%的甲醛浸泡固定48 h，逐級乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，進行組織切片，切片厚度4 μm，清洗，采用蘇木精染色，清洗，采用1% HCl 的無水乙醇固定，用伊紅染色，置于光學顯微鏡下觀察，包括大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)、細胞排列狀態(tài)、有無炎細胞浸潤及有無心肌間質(zhì)水腫。

1.4 TUNEL 法檢測大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）取大鼠心臟組織切片，乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，脫蠟至水，PBS 緩沖液清洗，蛋白激酶K 工作液處理15 min，PBS 緩沖液清洗；加入山羊非免疫血清封閉30 min，去血清，加兔來源 cTnI 一抗（1 ∶100），于4℃過夜；室溫復溫后，PBS 緩沖液沖洗3 次，加入山羊抗兔FITC 二抗，置于濕盒中37℃避光孵育1 h，PBS 緩沖液沖洗3 次。加入新配制的TUNEL 反應(yīng)液，于37℃避光孵育1 h。陽性對照加入100 μL DNase 1 室溫處理15 min，滴加熒光標記dUTP 液，PBS 緩沖液清洗。采用100 μg·L－1DAPI 復染10 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，封片液封片，共聚焦顯微鏡觀察，陽性細胞胞核呈棕褐色。每張切片隨機選取5 個視野，于400 倍顯微鏡下計數(shù)凋亡細胞，計算AI，AI=陽性細胞數(shù)/ 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）數(shù)×100%。

1.5 生化分析儀檢測各組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性各組大鼠在末次給藥后從眼眶后靜脈叢各取血5 mL，靜置1 h 后，離心并分離血清，采用DR700 半自動生化分析儀檢測LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性。

1.6 ELISA 法檢測各組大鼠心肌組織中SOD 和GSH-Px 活性及MDA 水平大鼠在末次給藥后用2%戊巴比妥鈉（0.3 mL·100 g－1）經(jīng)腹腔注射麻醉，取各組大鼠心肌組織稱質(zhì)量，按V∶W＝9∶1的比例加入生理鹽水，剪碎組織，冰上稀釋勻漿，離心并分離上清，按照試劑盒說明書檢測SOD 和GSH-Px 活性及MDA 水平。

1.7 ELISA 法檢測各組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平剪碎大鼠心臟組織，冰上稀釋勻漿，離心并分離上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.8 Western blotting 法檢測各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、ICAM-1、VCAM-1 和Caspase-3 蛋白表達水平收集各組大鼠待測心肌細胞，用RIPA 裂解細胞并提取總蛋白，SDS-PAGE 凝膠電泳分離各組蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF 膜。用5%BSA 封閉2 h 后更換為相應(yīng)的Bcl-2、Bax、ICAM-1、VCAM-1 和Caspase-3 一抗，4℃孵育過夜。第2 天加入二抗室溫孵育1 h，最后加入顯色液于凝膠成像儀曝影。以GAPDH 為內(nèi)參，對蛋白條帶進行半定量分析。目的蛋白相對表達水平＝目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組大鼠心肌細胞AI，血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性，心肌組織中SOD 和GSH-Px 活性及MDA、IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平，心肌組織中ICAM-1、VCAM-1、Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白表達水平，均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織形態(tài)表現(xiàn)假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，心肌細胞排列整齊，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠心肌間質(zhì)水腫，出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，低劑量黃芪注射液組大鼠炎性細胞浸潤明顯減輕，間質(zhì)水腫程度減輕；高劑量黃芪注射液組大鼠心肌細胞胞核大小均勻，無明顯水腫，少量炎性細胞浸潤。見圖1。

2.2 各組大鼠心肌細胞AI與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細胞AI 明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量黃芪注射液組大鼠心肌細胞AI 明顯降低（P＜0.05）；高劑量黃芪注射液組大鼠心肌細胞AI 明顯低于低劑量黃芪注射液組（P＜0.05）。見表1 和圖2。

2.3 各組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性與對照組比較，模型組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量黃芪注射液組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 水平均明顯降低（P＜0.05）；高劑量黃芪注射液組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性均明顯低于低劑量黃芪注射液組（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠心肌細胞AITab.1 AI of myocardiocytes of rats in various groups(n＝10,，η/%)

表1 各組大鼠心肌細胞AITab.1 AI of myocardiocytes of rats in various groups(n＝10,，η/%)

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；＃P＜0.05 compared with low dose of Astragalus Injection group.

2.4 各組大鼠心肌組織中SOD 和GSH-Px 活性及MDA 水平與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中SOD 和GSH-Px 活性明顯降低（P＜0.05），MDA 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中SOD 和GSH-Px 活性明顯升高（P＜0.05），MDA 水平明顯降低（P＜0.05）；與低劑量黃芪注射液組比較，高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中SOD 和GSHPx 活性明顯升高（P＜0.05），MDA 水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

2.5 各組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平明顯降低（P＜0.05）；高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6和TNF-α 水平明顯低于低劑量黃芪注射液組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性Tab.2 Activities of serum LDH,CK,α-HBDH,and ALT of rats in various groups

2.6 各組大鼠心肌組織中ICAM-1、VCAM-1、Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白表達水平與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中Bax、ICAM-1、VCAM-1 和Caspase-3 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中Bax、ICAM-1、VCAM-1 和Caspase-3 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與低劑量黃芪注射液組比較，高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中Bax、ICAM-1、VCAM-1 和Caspase-3 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。見圖3 和表3。

圖3 各組大鼠心肌組織中細胞凋亡相關(guān)蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of apoptosis-related proteins in myocardium tissue of rats in various groups

3 討論

睡眠剝奪類似于缺氧和低溫等刺激，可對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生一系列的負向調(diào)控，如氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)［1，9］、交感神經(jīng)激活［1，10］、血管內(nèi)皮功能紊亂［11］和內(nèi)分泌代謝紊亂［12］等，尤其是氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是睡眠剝奪影響心血管系統(tǒng)的重要因素。研究［1-2］顯示：睡眠剝奪不僅對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成顯著影響，同時也與心血管疾病關(guān)系密切。流行病學研究［3］顯示：心血管疾病的發(fā)病率與睡眠持續(xù)時間有密切關(guān)聯(lián)，睡眠剝奪更被認為是心血管疾病風險的獨立預測因子。黃芪在降血糖和血脂、抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗病毒、保護心血管系統(tǒng)、延緩衰老和提高機體免疫力等方面起到重要作用。但黃芪注射液對睡眠剝奪誘導心肌損傷的作用少有報道。本研究采用MMPWM 建立睡眠剝奪大鼠模型，探討黃芪注射液對睡眠剝奪誘導心肌損傷的保護機制。心肌酶主要包括LDH、CK、α-HBDH 和ALT，心肌組織損傷或壞死后心肌酶會不同程度地釋放到血液中，其活性可反映心肌細胞的受損程度［13-14］。本研究中，與模型組比較，低和高劑量黃芪注射液組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性均明顯降低，且高劑量黃芪注射液組大鼠血清中上述心肌酶活性下降更明顯，表明黃芪注射液可減少心肌酶的釋放，減輕心肌細胞的損傷，且其作用效果與劑量有關(guān)。ICAM-1 和VCAM-1 為炎癥主要黏附分子，主要在內(nèi)皮細胞和心肌細胞等細胞中表達。生理狀態(tài)下，ICAM-1 和VCAM-1 呈低水平表達，但受到各種炎癥因素刺激后其蛋白表達水平可上調(diào)［15］，導致組織器官結(jié)構(gòu)和功能的損傷。本研究中，睡眠剝奪模型大鼠心肌組織中ICAM-1 和VCAM-1 表達水平升高，誘導白細胞集聚和黏附，引起多種炎癥因子釋放，IL-1β、IL-6和TNF-α 水平升高進一步誘發(fā)微循環(huán)障礙，產(chǎn)生持續(xù)心肌損害。TNF-α 可通過細胞信號通路進一步引起氧化應(yīng)激，IL-1β 及IL-6 是促炎癥反應(yīng)的細胞因子，可由TNF-α 誘導產(chǎn)生，從而引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)［16-17］。本研究中，低和高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α的釋放明顯減少；另一方面，ICAM-1 和VCAM-1的釋放亦會誘發(fā)自由基釋放增加，加劇心肌損傷；SOD 和GSH-Px 是機體中具有重要抗氧化作用的酶，其水平直接反映機體清除活性氧簇的能力［18-20］；MDA 是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，其水平高低與機體內(nèi)自由基水平有關(guān)聯(lián)，主要反映機體受自由基損傷的程度［21-22］；本研究中，低和高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中SOD 及GSH-Px 活性均不同程度升高、MDA 水平則明顯下降，表明黃芪注射液具有較好的抗氧化能力。黃芪還能上調(diào)大鼠心肌組織中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，并下調(diào)促凋亡蛋白Bax 和Caspase-3 表達，表明黃芪注射液可減少心肌細胞凋亡，從而起到保護睡眠剝奪大鼠心肌組織的作用，且高劑量黃芪注射液組大鼠心肌細胞損傷的改善情況優(yōu)于低劑量黃芪注射液組。

表3 各組大鼠心肌組織中ICAM-1、VCAM-1、Bax、Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of ICAM-1,VCAM-1,Bax,Bcl-2 and Caspase-3 protein in myocardium tissue of mice various groups

綜上所述，黃芪注射液可保護睡眠剝奪導致的大鼠心肌組織損傷，其作用機制可能與減輕氧化應(yīng)激、下調(diào)黏附分子和凋亡蛋白表達、減少心肌細胞凋亡和炎癥因子釋放有關(guān)，且在一定范圍內(nèi)呈劑量-效應(yīng)依賴性。