骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中硬化蛋白表達(dá)的影響及其作用機(jī)制

孫景春,金輝,楊雯棋,徐輝

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科，吉林 長(zhǎng)春 130033；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130021）

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨強(qiáng)度降低和易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病，可發(fā)生于不同性別和年齡人群中，但多見于絕經(jīng)后婦女和老年男性。2018 年10 月，國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的首個(gè)中國(guó)骨質(zhì)疏松癥流行病學(xué)調(diào)查［1］結(jié)果顯示：骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為我國(guó)50 歲以上人群的重要健康問題，從而造成沉重的家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。骨細(xì)胞是維持成熟骨新陳代謝的主要細(xì)胞，年輕的骨樣骨細(xì)胞在調(diào)控骨生長(zhǎng)和骨轉(zhuǎn)換中非常重要，骨細(xì)胞通過調(diào)控骨轉(zhuǎn)換在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。骨細(xì)胞參與骨轉(zhuǎn)換的作用途徑主要是通過調(diào)控骨硬化蛋白（sclerostin，SOST）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）受體激活劑配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）的產(chǎn)生［2］。SOST 可以拮抗Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路負(fù)性調(diào)節(jié)骨形成。SOST 可通過結(jié)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體和Wnt 的共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6），負(fù)向調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白和Wnt 信號(hào)途徑來(lái)調(diào)控成骨細(xì)胞分化和骨形成。研究［3］表明：抑制SOST為骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新的途徑。骨碎補(bǔ)總黃酮具有補(bǔ)益肝腎、活血止痛和強(qiáng)筋壯骨等功效。趙金龍等［4］通過系統(tǒng)藥理學(xué)和相關(guān)生物信息學(xué)分析方法探討中藥材骨碎補(bǔ)治療骨質(zhì)疏松癥的生物學(xué)通路及靶標(biāo)。謝雁鳴等［5］研究結(jié)果顯示：骨碎補(bǔ)總黃酮可通過提高原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者的骨密度，抑制骨吸收，減少骨量丟失等環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的治療作用。本研究通過維甲酸誘導(dǎo)建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，應(yīng)用骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)其進(jìn)行用藥干預(yù)，觀察骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)骨細(xì)胞分泌SOST 的影響，探討骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松癥的作用效果及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器40 只雌性Sprague-Dawley 大鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006；維甲酸購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，阿侖膦酸鈉購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司，骨碎補(bǔ)總黃酮（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030007）購(gòu)于北京岐黃醫(yī)藥股份有限公司，TRIzol 試劑購(gòu)于美國(guó)Ambion 公司，RIPA 蛋白裂解液購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，SOST 兔多克隆抗體（anti-sclerostin）購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific 公司，基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，熒光定量PCR 試劑購(gòu)于德國(guó)Roche 公司；AU680 全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司），Quant Studio 7 Flex 型StepOnePlus Real-Time PCR system（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），VE-180 型凝膠電泳儀和VE-186 型轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及骨質(zhì)疏松模型制備將40 只8 月齡雌性大鼠分為正常對(duì)照組、骨質(zhì)疏松模型組、陽(yáng)性藥組和骨碎補(bǔ)總黃酮組，每組10 只。除正常對(duì)照組外，其余3 組大鼠采用維甲酸灌胃給藥方法制備骨質(zhì)疏松模型。正常對(duì)照組大鼠每天采用等量生理鹽水灌胃；骨質(zhì)疏松模型組大鼠以90 mg·kg－1·d－1維甲酸灌胃給藥，持續(xù)14 d；陽(yáng)性藥組大鼠以維甲酸灌胃14 d，同時(shí)皮下注射0.1 mg·kg－1·d－1阿侖膦酸鈉30 d；骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠以維甲酸灌胃14 d，同時(shí)以58 mg·kg－1·d－1骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃給藥30 d。在實(shí)驗(yàn)過程中，各組大鼠均自由活動(dòng)和攝食飲水，對(duì)大鼠的體質(zhì)量和體征進(jìn)行觀察并記錄，實(shí)驗(yàn)周期為30 d。

1.3 各組大鼠血清中生化指標(biāo)檢測(cè)給藥結(jié)束后采用乙醚麻醉大鼠，以眼眶靜脈叢取血。血液離心后收集上清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中鈣、磷和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平，肝和腎功能指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、肌酐（creatinine，Crea）和尿素氮（blood urea nitroger，BUN）。

1.4 各組大鼠骨組織HE 染色給藥結(jié)束后采用乙醚麻醉大鼠，收集大鼠兩側(cè)股骨，取大鼠一側(cè)股骨進(jìn)行甲醛固定，HE 染色，觀察大鼠股骨干骺端骨組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 qRT-PCR 法檢測(cè)大鼠骨組織中SOST mRNA表達(dá)水平取大鼠另一側(cè)股骨和脛骨經(jīng)液氮研磨成粉末，采用TRIzol 試劑抽提骨組織的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用StepOnePlus Real-Time PCR system 進(jìn)行擴(kuò)增特異性SOST 的基因片段。反應(yīng)體系（20 μL）：熒光定量PCR 試劑Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）10 μL，正、反向引物各2μL，模板0.5 μL，雙蒸水5.5 μL。引物序列： SOST，上游引物5'-GCTCTCCACAGCAACGAAGG-3'，下游引物5'-TGCAGCTCTCACTAGCCCCT-3'；GAPDH，上游引物5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3'，下游引物5'-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，以樣品的2－△△Ct值（Ct 為循環(huán)數(shù)）代表SOST mRNA 表達(dá)水平。

1.6 Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠骨組織中SOST 蛋白表達(dá)水平取“1.5”中的部分大鼠股骨和脛骨經(jīng)液氮研磨成粉狀，將適宜濃度的骨組織樣本與上樣緩沖液按照一定比例混合，95℃變性5 min 后，將變性的樣本按照順序和劑量加入凝膠，在恒壓條件下進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，用PVDF 膜與凝膠的分離膠部分貼好轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉后，與SOST 抗體（1∶1 000）孵育過夜。孵育后的PVDF 膜用TBST 液體洗3 次，再將PVDF 膜浸于二抗goat anti-rabbit 抗體（1∶10 000）搖床孵育85 min。最后，PVDF 膜加入發(fā)光液，在暗室內(nèi)進(jìn)行膠片顯影。以β-actin 作為參照物，采用Gel-Pro analyzer 軟件進(jìn)行蛋白條帶吸光度（A）值分析，以目的蛋白條帶A 值與內(nèi)參β-actin 條帶A 值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠血清中各生化指標(biāo)及骨組織中SOST mRNA 和蛋白表達(dá)水平經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 和DUNCAN 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中鈣、磷和ALP 水平與正常對(duì)照組比較，骨質(zhì)疏松模型組大鼠血清中磷和ALP 水平稍有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與骨質(zhì)疏松模型組比較，陽(yáng)性藥組大鼠血清中鈣和磷水平明顯降低（P＜0.01），而骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠血清中鈣水平明顯升高（P＜0.05）；與陽(yáng)性藥組比較，骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠血清中鈣、磷和ALP 水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清中鈣、磷和ALP 水平Tab.1 Levels of serum calcium,phosphorus and ALP of rats in various groups(n＝8，）

表1 各組大鼠血清中鈣、磷和ALP 水平Tab.1 Levels of serum calcium,phosphorus and ALP of rats in various groups(n＝8，）

*P＜0.05 compared with normal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with osteoporosis model group；#P＜0.05，##P＜0.01 compared with positive drug group.

2.2 各組大鼠血清中肝和腎功能指標(biāo)各組大鼠血清中ALT、AST 和BUN 水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，骨質(zhì)疏松模型組、陽(yáng)性藥組和骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠血清中Crea 水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組和陽(yáng)性藥組比較，骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠血清中Crea 水平明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清中ALT、AST、Crea 和BUN 水平Tab.2 Levels of ALT,AST,Crea and BUN in serum of rats in various groups(n＝8，）

表2 各組大鼠血清中ALT、AST、Crea 和BUN 水平Tab.2 Levels of ALT,AST,Crea and BUN in serum of rats in various groups(n＝8，）

*P＜0.05 compared with normal control group；△P＜0.05 compared with osteoporosis model group；#P＜0.05 compared with positive drug group.

2.3 各組大鼠股骨干骺端組織病理形態(tài)表現(xiàn)正常對(duì)照組大鼠股骨干骺端骨小梁較多較厚，無(wú)明顯吸收或斷裂現(xiàn)象；骨質(zhì)疏松模型組大鼠股骨干骺端骨小梁變薄，排列稀疏，骨髓腔變大，可見明顯的類骨質(zhì)堆積，表明骨質(zhì)疏松大鼠模型制備成功；與骨質(zhì)疏松模型組比較，陽(yáng)性藥組大鼠股骨干骺端骨小梁厚度明顯增加，仍可見少量斷裂和類骨質(zhì)堆積；骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠股骨干骺端骨小梁較模型組的連續(xù)性好，斷裂少，骨小梁厚度也增加，類骨質(zhì)堆積較不明顯。見圖1。

2.4 各組大鼠骨組織中SOST mRNA 和蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥組和骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠骨組織SOST mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），骨質(zhì)疏松模型組大鼠骨組織中SOST mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與骨質(zhì)疏松模型組比較，陽(yáng)性藥組和骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠骨組織中SOST mRNA 表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）。陽(yáng)性藥組大鼠骨組織中SOST 蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組和骨質(zhì)疏松模型組均明顯降低（P＜0.01），骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠骨組織中SOST 蛋白表達(dá)水平雖較正常對(duì)照組和骨質(zhì)疏松模型組低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2 和表3。

3 討論

圖2 各組大鼠骨組織中SOST 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of SOST protein in bone tissue of rats in various groups

表3 各組大鼠骨組織中SOST mRNA 和蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of SOST mRNA and protein in bone tissue of rats in various groups(n＝3，）

表3 各組大鼠骨組織中SOST mRNA 和蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of SOST mRNA and protein in bone tissue of rats in various groups(n＝3，）

*P＜0.01 compared with normal control group；△P＜0.01 compared with osteoporosis model group.

隨著老齡化人口的逐漸增加，骨質(zhì)疏松癥作為衰老人群的常見病癥之一，現(xiàn)已成為研究熱點(diǎn)［6-7］，骨質(zhì)疏松癥主要是以骨量減少、骨組織微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，導(dǎo)致骨的脆性增加，易發(fā)生骨折。目前，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，臨床治療藥物也存在耐藥和不良反應(yīng)的問題［8-9］。

骨質(zhì)疏松癥研究的常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型為雌性動(dòng)物切除卵巢造成雌激素缺乏，成骨降低，破骨不受抑制；也有大劑量地塞米松引起的活躍破骨型的骨質(zhì)疏松，以及相類似的大劑量維甲酸誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥等模型［10-12］。本研究采用維甲酸灌胃法制備大鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，是基于維甲酸增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，刺激骨吸收，造成骨轉(zhuǎn)換加強(qiáng)而引起骨質(zhì)疏松。在本研究中使用阿侖膦酸鈉作為陽(yáng)性藥，不僅因?yàn)樵撍帒?yīng)用于抗骨質(zhì)疏松臨床治療多年，而且該藥的藥效機(jī)制是抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，符合維甲酸復(fù)制骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的特點(diǎn)。賈婷婷等［13］研究顯示：采用維甲酸制備的骨質(zhì)疏松模型大鼠的脛骨骺端可觀察到皮質(zhì)骨面積降低，骨小梁變窄且稀疏，呈松散狀態(tài)，數(shù)目減少，骨小梁分離度增加；正常對(duì)照組大鼠皮質(zhì)骨面積正常，骨小梁密集，間距小，交織連續(xù)呈網(wǎng)狀。本研究結(jié)果顯示：在骨質(zhì)疏松大鼠股骨干骺端也觀察到了骨小梁變薄、排列稀疏、斷裂明顯和骨髓腔變大，表明維甲酸已導(dǎo)致大鼠骨質(zhì)疏松；陽(yáng)性藥組和骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠干骺端的骨小梁厚度增加，骨小梁斷裂減少，再次證明了骨碎補(bǔ)總黃酮在治療骨質(zhì)疏松方面的藥用價(jià)值［14］。

在本研究中也觀察了骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝和肝腎功能指標(biāo)的影響，結(jié)果表明：阿侖膦酸鈉能夠抑制骨吸收，從而降低大鼠血清中鈣和磷水平。而骨碎補(bǔ)總黃酮能提高ALP 的酶活性，反映了骨碎補(bǔ)總黃酮刺激成骨作用的潛能。研究［15］表明：骨碎補(bǔ)提取物治療去勢(shì)大鼠，能夠通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮素1 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平，改善骨代謝，較低劑量骨碎補(bǔ)提取物對(duì)提高骨密度起到促進(jìn)作用，高劑量時(shí)效果更為明顯。本研究通過對(duì)大鼠肝腎功能指標(biāo)的分析表明：維甲酸制備骨質(zhì)疏松模型對(duì)大鼠的肝腎功能影響輕微，骨碎補(bǔ)總黃酮無(wú)明顯的肝腎不良反應(yīng)。

本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)分析了給予骨碎補(bǔ)總黃酮后骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中SOST 的表達(dá)情況。SOST 作為骨細(xì)胞的標(biāo)志物之一，是骨形成的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，也可以通過刺激骨細(xì)胞從而調(diào)控破骨細(xì)胞的形成和活性，還可以調(diào)控骨的礦化來(lái)調(diào)節(jié)骨結(jié)構(gòu)的改變［16］。甲狀旁腺激素和雌激素可抑制SOST 基因表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子Osterix、Runx2 和Mef2c 可促進(jìn)SOST 基因表達(dá)，而沉默信號(hào)調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，Sirt1）負(fù)調(diào)控SOST 基因表達(dá)［17］。SOST 單克隆抗體目前正被廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松和骨折不愈合的基礎(chǔ)與臨床研究領(lǐng)域。其中，Evenity（romosozumab）是2019 年美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)的治療骨質(zhì)疏松的單克隆抗體新藥［18］。因此，SOST 在骨質(zhì)疏松防治方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果顯示：骨質(zhì)疏松模型大鼠骨組織中SOST 表達(dá)水平升高，而阿侖膦酸鈉和骨碎補(bǔ)總黃酮可明顯抑制骨組織中SOST mRNA 的表達(dá)，骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠骨組織中SOST 蛋白表達(dá)水平降低，提示骨碎補(bǔ)總黃酮能夠抑制骨細(xì)胞產(chǎn)生SOST。骨碎補(bǔ)總黃酮通過抑制SOST 而促進(jìn)成骨，抑制破骨，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的［19-21］。

綜上所述，骨碎補(bǔ)總黃酮拮抗原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制可能是通過抑制骨細(xì)胞合成SOST，刺激成骨細(xì)胞活性，抑制破骨因子，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)骨組織形成的作用。但骨碎補(bǔ)總黃酮作為一種混合物，目前仍不能確定其發(fā)揮作用的主要活性成分，需進(jìn)一步深入研究。