SIRPα-GFP 真核表達載體構(gòu)建及其在HEK293T 細胞中的表達

王明月,王浩,王冬梅,楊澤斌,崔梅英,劉寧,黃莉莉,關(guān)新剛

（北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院腫瘤靶向治療重點實驗室，吉林 吉林 132013）

信號調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein-α，SIRPα），也被稱為CD172a 或SHPS-1，是屬于免疫球蛋白超家族中的一種膜蛋白，是一種在巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞等髓系細胞上表達的抑制性受體分子［1］。CD47 是SIRPα 的天然配體，在多種生理病理過程中均發(fā)揮作用［2-4］。正常的血液系統(tǒng)細胞表面均有CD47 表達，CD47-SIRPα 通路在紅細胞老化吞噬過程中發(fā)揮作用［5］。SIRPα 作為巨噬細胞上的關(guān)鍵免疫抑制受體，與SIRPα 配體CD47 的相互作用可阻止自體吞噬作用，因此可以利用CD47 與SIRPα 識別抑制巨噬細胞的吞噬作用和移植排斥反應(yīng)［6-7］。SIRPα 除在巨噬細胞表面表達外，還在中性粒細胞的表面呈高水平表達，多種腫瘤中CD47 分子呈高水平表達，巨噬細胞和中性粒細胞表面的SIRPα 與其識別結(jié)合后，會介導(dǎo)免疫抑制，發(fā)生免疫逃逸，從而促進腫瘤的發(fā)展［8-9］。CD47-SIRPα 信號通路為腫瘤治療提供了新的思路，通過阻斷CD47-SIRPα 信號通路激活吞噬細胞對腫瘤的吞噬，增強腫瘤抗原遞呈，引發(fā)機體抗腫瘤免疫反應(yīng)，殺傷腫瘤細胞［10-11］。本研究通過構(gòu)建融合表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的SIRPα 真核表達載體，制備穩(wěn)定表達SIRPα-GFP 的HEK293T 細胞系，并研究SIRPα-GFP 在細胞中的表達定位，為后續(xù)SIRPα的功能研究以及CD47-SIRPα 信號通路阻斷研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器HEK293T 細胞為本實驗室凍存。培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，pLenti-C-mGFP 質(zhì)粒和pCMV6-SIRPα 質(zhì)粒購自美國Origene 公司，MluⅠ和SgfⅠ限制性內(nèi)切酶購自日本TaKaRa 公司，T4 DNA 連接酶購自上海碧云天生物技術(shù)公司，DH5α 感受態(tài)細胞和卡那霉素購自生工生物工程（上海）股份有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自美國Axyprep 公司，Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司，單克隆SIRPα 抗體購自美國Biolegend 公司，蛋白預(yù)染Marker、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）和顯色底物購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。核酸電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad 公司，倒置熒光顯微鏡購自美國Lifte-Technologies 公司，全自動多功能酶標儀購自瑞士TECAN 公司。

1.2 SIRPα 真核表達載體的構(gòu)建和鑒定將測序正確的pLenti-C-mGFP 質(zhì)粒與pCMV6-SIRPα 質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶MluⅠ和SgfⅠ進行雙酶切：各取2 μ g 質(zhì)粒，加入1 μ L 限制性內(nèi)切酶MluⅠ和SgfⅠ，37℃水浴4 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離并對相關(guān)片段進行凝膠回收，利用T4 DNA 快速連接酶在25℃水浴連接1 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細胞，接種到含有卡那霉素的LB 平板培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。從平板培養(yǎng)基中挑取單個菌落，160 r·min-1搖床過夜，提取質(zhì)粒后用MluⅠ和SgfⅠ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，在0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測雙酶切后DNA 片段大小。雙酶切驗證成功的質(zhì)粒DNA 送到生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA 測序分析。

1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞HEK293T 細胞在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，將對數(shù)生長期的HEK293T 細胞以每孔1×106個細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，使細胞在第2 天達到70%～80% 融合度。第2 天，從培養(yǎng)箱中取出6 孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的HEK293T 細胞，吸除原有培養(yǎng)基，加入2 mL PBS 緩沖液清洗細胞2 次后，換為Opti-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。利用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑，將2 μg 質(zhì)粒DNA 以及10 μL 轉(zhuǎn)染試劑分別與125 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基混勻，之后將帶有質(zhì)粒DNA 的混合物加入到帶有轉(zhuǎn)染試劑的試管中，混勻后室溫靜置15 min，加入到6 孔細胞培養(yǎng)板HEK293T 細胞培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染48 h 后在熒光顯微鏡下488 nm 激發(fā)光觀察SIRPα-GFP 綠色熒光的表達及細胞膜定位情況。

1.4 Western blotting 法檢測HEK293T 細胞中SIRPα-GFP 融合蛋白的表達為了對轉(zhuǎn)染后的HEK293T 細胞進行篩選，轉(zhuǎn)染48 h 后將細胞轉(zhuǎn)移到10cm 培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)，使細胞在24 h 后達到40%～50% 的融合度，更換為含有嘌呤霉素（8 mg·L－1）的新鮮培養(yǎng)基，每隔2 d 棄去原有培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液清洗2 遍，更換含有嘌呤霉素（8 mg·L－1）的新鮮培養(yǎng)基，此步驟重復(fù)3 次。已經(jīng)篩選后的細胞，擴大培養(yǎng)后收集細胞，PBS 緩沖液清洗2～3 次，用RIPA 裂解液冰上裂解60 min，每隔10 min 顛倒混勻，之后將裂解物經(jīng)12 000 g、4℃離心30 min，留取上清進行蛋白定量以及Western blotting 法驗證。取30 μg 總蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE 凝膠分離，25 V 恒壓14 min 轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。PVDF 膜用含有5% 脫脂奶粉的TBST 封閉液室溫封閉2 h，與稀釋后的SIRPα 一抗（1∶1 000 稀釋）和Actin 一抗（1∶1 000 稀釋）在4℃搖床孵育過夜。過夜后的PVDF 膜用TBST 清洗3 次，每次10 min，再與羊抗鼠二抗（1∶1 000 稀釋）室溫孵育2 h，經(jīng)TBST 洗膜3 次，每次10 min。將膜放置于顯影儀曝光板上，將特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（BeyoECL Star）中的A 液和B 液按1∶1 比例混合，覆蓋到膜上，曝光30 s，拍攝圖像，若在相對分子質(zhì)量為83 000附近出現(xiàn)清晰條帶則提示SIRPα-GFP 融合蛋白表達成功。

2 結(jié)果

2.1 SIRPα-GFP 真核表達載體的構(gòu)建本研究利用現(xiàn)有的慢病毒質(zhì)粒pLenti-C-mGFP 作為真核表達載體進行重組質(zhì)粒構(gòu)建。將表達載體pLenti-CmGFP與SIRPα質(zhì)粒（pCMV6-SIRPα）用限制性內(nèi)切酶MluⅠ和SgfⅠ雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，pLenti-C-mGFP 質(zhì)粒雙酶切后可見長度約為756 bp 的片段，pCMV6-SIRPα 質(zhì)粒雙酶切后可見長度約為1 527 bp 的片段（圖1）。目的片段凝膠回收后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Kana 平板，陽性菌落在進行質(zhì)粒提取后通過MluⅠ和SgfⅠ雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒雙酶切后可見約為7800和1 500bp的2個DNA條帶，與pLenti-C-mGFP 載體及SIRPα 基因大小相符（圖2），提示重組質(zhì)粒pLenti-SIRPα-GFP 構(gòu)建成功。

圖1 GFP 表達載體（pLenti-C-mGFP）和SIRP α 質(zhì)粒（pCMV6-SIRPα）雙酶切結(jié)果Fig.1 Double digestion results of GFP expression vector（pLenti-C-mGFP）and SIRPα plasmid（pCMV6-SIRPα）

圖2 重組質(zhì)粒pLenti-SIRPα-GFP 的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pLenti-SIRPα-GFP by double digestion

2.2 真核表達載體的DNA 序列測定將重組質(zhì)粒pLenti-SIRPα-GFP 進行DNA 序列測定分析，測序結(jié)果顯示：SIRPα 基因成功插入到pLenti-C-mGFP載體中的SgfⅠ位點（GCGATCGCC），提示SIRPα-GFP 重組質(zhì)粒pLenti-SIRPα-GFP 構(gòu)建成功（圖3）。

2.3 SIRPα-GFP 重組質(zhì)粒的真核表達通過Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒pLenti-SIRPα-GFP 轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，48 h 后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。綠色熒光清晰地表達在轉(zhuǎn)染后的HEK293T 細胞膜上，與文獻［9］報道的SIRPα蛋白的膜定位一致。見圖4。

2.4 Western blotting 法檢測SIRPα 蛋白表達轉(zhuǎn)染空載體pLenti-C-mGFP 的HEK293T 細胞及轉(zhuǎn)染pLenti-SIRPα-GFP 后的HEK293T 細胞裂解后，采用Western blotting 法檢測HEK293T 細胞中SIRPα蛋白的表達，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pLenti-SIRPα-GFP質(zhì)粒的HEK293T 細胞裂解液在相對分子質(zhì)量為83 000 附近出現(xiàn)清晰的條帶，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HEK293T 細胞裂解液則未檢測出，考慮到SIRPα和GFP 蛋白的相對分子質(zhì)量分別為56 000 及27 000，提示利用SIRPα 抗體檢測的特異性條帶為SIRPα-GFP融合蛋白。Western blotting 法檢測結(jié)果表明：SIRPα-GFP 融合蛋白在HEK293T 細胞中成功表達。見圖5。

圖5 Western blotting 法檢測HEK293T 細胞中SIRPα-GFP 蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expression of SIRP α -GFP protein in HEK293T cells detected by Western blotting method

3 討論

腫瘤細胞通過表達與免疫細胞表面受體相互作用的活化或抑制性配體來逃避免疫監(jiān)視［12］。腫瘤與免疫細胞之間的相互作用可防止腫瘤被免疫系統(tǒng)殺傷，促進腫瘤細胞的增殖［13-14］。腫瘤細胞通過過度表達的CD47 分子識別免疫細胞表面表達的SIRPα分子，使腫瘤能夠逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視，因此CD47-SIRPα 信號通路在腫瘤治療等方面作用的研究受到越來越多的關(guān)注［15-16］。SIRPα是SIRP家族中一個典型的抑制性受體，在巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜中性粒細胞和神經(jīng)元上具有高水平的表達，研究［17］表明：SIRPα 在生理和病理過程中均發(fā)揮重要作用。SIRPα 代表一種髓樣特異性免疫檢查點，與腫瘤細胞表面高表達的“不要吃我”信號CD47 結(jié)合，會抑制免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的攻擊［18］。因此阻斷SIRPα 與CD47 的識別，會切斷CD47-SIRPα信號通路對免疫系統(tǒng)的抑制，恢復(fù)免疫細胞的吞噬殺傷作用，達到治療腫瘤的目的［19-20］。

GFP作為示蹤標記，對宿主細胞不具有毒性，不會影響目的蛋白的表達，可以直接在顯微鏡下觀察融合蛋白表達和定位，因此在融合蛋白真核表達研究中具有不可替代的作用［21-23］。由于HEK293 細胞生長繁殖速度快且極少表達細胞外配體所需的內(nèi)生受體，且比較容易轉(zhuǎn)染［24-25］，因此選用HEK293T 細胞作為目的細胞。本研究構(gòu)建SIRPα-GFP 真核表達載體，利用GFP 起到示蹤的目的，熒光顯微鏡下觀察HEK293T 細胞中融合蛋白的表達及定位，結(jié)果表明：SIRPα-GFP 融合蛋白在HEK293T 細胞膜上表達；Western blotting 法檢測結(jié)果進一步驗證了重組質(zhì)粒SIRPα-GFP 轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞后融合蛋白的表達。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了SIRPα-GFP 真核表達載體，并利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑成功轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，SIRPα-GFP 融合蛋白在HEK293T細胞中表達并位于HEK293T 細胞膜上，為后續(xù)SIRPα 的功能研究奠定基礎(chǔ)。