吡柔比星對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的損傷作用及其模型建立

李琪,徐瑞,李藤藤,江一川,李敏,

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科，遼寧 錦州 120001；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春 130021）

蒽環(huán)類藥物是多種實(shí)體腫瘤和血液淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的基礎(chǔ)性治療藥物。臨床研究［1-2］顯示：蒽環(huán)類藥物可誘導(dǎo)心臟毒性發(fā)生，且常呈進(jìn)展性和不可逆性。由于蒽環(huán)類藥物導(dǎo)致的心臟毒性反應(yīng)發(fā)生的復(fù)雜性和臨床表現(xiàn)的多樣性，目前尚無(wú)有效的治療方法。近年來(lái)，抗腫瘤藥物心臟毒性的研究成為熱點(diǎn)，蒽環(huán)類藥物導(dǎo)致的心臟毒性模型和心肌細(xì)胞損傷模型也逐漸在相關(guān)的研究中被廣泛使用。其中，阿霉素（doxorubicin，DOX）誘導(dǎo)為目前國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究中常用制備心肌細(xì)胞損傷模型的方法，但其細(xì)胞死亡率較高［3-5］，干預(yù)手段常不能明顯緩解心肌細(xì)胞的損傷。DOX 作為第1 代蒽環(huán)類藥物，因其抗腫瘤針對(duì)性弱、心臟毒性大，臨床上已逐漸被第3 代蒽環(huán)類藥物吡柔比星（theprubicin，THP）等所取代。目前THP 在臨床中廣泛應(yīng)用，但在接受THP 化療的患者依然會(huì)出現(xiàn)不同程度的心臟毒性反應(yīng)，限制其長(zhǎng)期使用。深入研究蒽環(huán)類藥物導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷，尋找恰當(dāng)?shù)念A(yù)防蒽環(huán)類藥物導(dǎo)致的心臟毒性反應(yīng)的手段仍然是腫瘤和心血管疾病研究的熱點(diǎn)。由于DOX 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的模型存在諸多缺陷，根據(jù)臨床上蒽環(huán)類藥物的實(shí)際應(yīng)用情況，建立THP 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型具有現(xiàn)實(shí)意義。因此，本研究采用THP 作為造模藥物，對(duì)比分析不同時(shí)間、不同濃度THP 誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞（H9C2 細(xì)胞）的損傷情況，探討THP 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型的建立條件，為今后開展蒽環(huán)類藥物心臟毒性的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、藥品、主要試劑和儀器大鼠H9C2細(xì)胞由吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室凍存。注射用THP（深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司），DMEM 高糖培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone 公司），CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），DCFH-DA 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒（上海祤圣生物科技有限公司），丙二醛（malonaldehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶公司），乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）活性檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），TUNEL試劑盒（瑞士羅氏公司），TRIzol 試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），總蛋白提取試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。倒置熒光顯微鏡和生物顯微鏡（日本Nikon 公司），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)MD 公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國(guó)耶拿公司），電泳槽、流式細(xì)胞儀、CO2恒溫培養(yǎng)箱和JJ260 型精密電子天平（美國(guó)BD 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)H9C2細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)并傳代，0.25%胰蛋白酶消化，每2～3 d 消化傳代1 次。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率在DMEM中制備濃度分別為1×10－6、1×10－5、1×10－4和1×10－3mol·L－1的THP工作液。將細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔5×104個(gè)細(xì)胞），分別培養(yǎng)12、24、36 和48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，37℃孵育2 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處吸光度（A）值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A 值/對(duì)照組A 值×100%。根據(jù)結(jié)果選擇THP 最佳造模濃度（1～10 μmol·L－1）和時(shí)間（24 h），隨后采用不同濃度THP（1、3、5、7 和9 μmol·L－1）處理細(xì)胞24 h，加入10 μL CCK-8，37℃孵育2 h，再次檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。

1.4 光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)將細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔1×106個(gè)細(xì)胞）中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分為空白對(duì)照組和不同濃度THP 組，分別采用0、1、5 和9 μmol·L－1THP 處理24h后，將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，并拍照記錄。

1.5 DCFH-DA ROS 試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS水平使用DCFH-DAROS 檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞中ROS 水平。將細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔1×106個(gè)細(xì)胞）中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分為空白對(duì)照組和不同濃度THP 組，分別采用0、1、5 和9 μmol·L－1THP 處理24 h。吸除棄液，用無(wú)血清DMEM清洗2次，加入1mL DCFH-DA（10 μmol·L－1），37℃孵育30 min，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 各組細(xì)胞中MDA 水平及SOD 和LDH 活性檢測(cè)將細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔1×106個(gè)細(xì)胞）中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分為空白對(duì)照組和不同濃度THP 組，分別采用0、1、5 和9 μmol·L－1THP處理24 h，收集各組細(xì)胞，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

1.7 TUNEL 試劑盒檢測(cè)H9C2 細(xì)胞凋亡率將高壓滅菌多聚賴氨酸處理過(guò)的蓋玻片放入6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞分組同“1.6”，將細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔1×106個(gè)細(xì)胞）中培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛中固定25 min，按照TUNEL 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。應(yīng)用熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞，任選1 個(gè)視野進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算H9C2 細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/全部細(xì)胞×100%。

1.8 qRT-PCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞中B 淋巴細(xì)胞瘤2相關(guān)X 蛋白（Bax）、B 淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和半胱氨酸蛋白酶9（Caspase-9）mRNA 水平將細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔1×106個(gè)細(xì)胞）中培養(yǎng)24h。細(xì)胞分組同“1.6”，采用THP（1、5 和9 μmol·L－1）處理各組細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞，TRIzol 法提取細(xì)胞中的總RNA，實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，步驟參照cDNA 合成試劑盒，根據(jù)qRT-PCR 試劑盒檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 mRNA 表達(dá)水平，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。反應(yīng)程序：94℃、15 s（變性）；58℃、15 s（退火），72℃、15 s（延伸），40 個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量2－△△Ct法計(jì)算各組細(xì)胞目的基因mRNA表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Sequences of qRT-PCR primers

1.9 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平將細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔1×106個(gè)細(xì)胞）中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分組和處理見(jiàn)“1.6”。收集細(xì)胞，按照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取各組總蛋白，采用BCA 定量，進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，Western blotting 法封閉液封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日加入用Western blotting 法二抗稀釋液稀釋后的二抗，并在室溫?fù)u床孵育2 h，按照高敏感度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書滴加發(fā)光工作液顯色后，以 GAPDH 為內(nèi)參，采用 Image proplus 6.0 軟件進(jìn)行灰度分析。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及的抗體及稀釋濃度見(jiàn)表2。目的蛋白表達(dá)水平＝目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組H9C2 細(xì)胞存活率，細(xì)胞凋亡率，各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9 mRNA 表達(dá)水平和Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布且方差齊，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 Western blotting 法檢測(cè)中使用的抗體和稀釋濃度比例Tab.2 Antibodies and dilutions used in Western blotting method detection

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率及倒置顯微鏡下H9C2 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)CCK-8 法檢測(cè)THP 細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示：THP 最佳造模時(shí)間為24 h，見(jiàn)圖1A；造模濃度范圍為1×10－6～1×10－5mol·L－1，見(jiàn)圖1A 和B。與空白對(duì)照組比較，1、3、5、7 和9 μmol·L－1THP 組細(xì)胞存活率均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），各組細(xì)胞存活率見(jiàn)圖1C。倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示：THP 處理后的細(xì)胞形態(tài)變小、數(shù)量減少，甚至死亡漂浮，見(jiàn)圖2。根據(jù)以上結(jié)果，選擇1、5 和9 μmol·L－1THP 組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 各組H9C2 細(xì)胞的存活率Fig.1 Survival rates of H9C2 cells in various groups

圖2 各組H9C2 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)（×40）Fig.2 Morphology of H9C2 cells in various groups（×40）

2.2 各組H9C2 細(xì)胞中ROS 和MDA水平及SOD 和LDH 活性DCFH-DA 探針?lè)z測(cè)細(xì)胞中ROS 水平，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，1、5 和9 μmol·L－1THP 組細(xì)胞中ROS 水平升高，且呈濃度依賴性。5μmol·L－1THP組細(xì)胞形態(tài)正常；9 μmol·L－1THP 組細(xì)胞變圓，見(jiàn)圖3。與空白對(duì)照組比較，1 μmol·L－1THP 組細(xì)胞中MDA 水平和SOD 活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），5 和9 μmol·L－1THP 組細(xì)胞中MDA 水平明顯升高（P＜0.01），SOD 活性明顯降低（P＜0.01），1、5 和9 μmol·L－1THP 組LDH 活性明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組細(xì)胞中MDA 水平及SOD 和LDH 活性Fig.4 Intracellular MDA levels and SOD and LDH activities in various groups

2.3 各組H9C2 細(xì)胞凋亡率1、5 和9 μmol·L－1THP 組的細(xì)胞凋亡率分別為（7.01±3.03）%、（42.09±4.98）%和（92.21±3.08）%，較空白對(duì)照組（1.05%±0.94%）明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

2.4 各組細(xì)胞中 Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9mRNA表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較，1、5 和9 μmol·L－1THP 組細(xì)胞中Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），1 μmol·L－1

THP 組Caspase-9 mRNA 表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），5 和9 μmol·L－1THP 組Caspase-9 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

2.5 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3 和Cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較，1、5 和9 μmol·L－1THP 組細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3 和Cleaved Caspase-9 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

表3 qRT-PCR 法檢測(cè)各組H9C2 細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 mRNA 表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in H9C2 cells in various groups determined by qRTPCR method(n＝3，）

表3 qRT-PCR 法檢測(cè)各組H9C2 細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 mRNA 表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in H9C2 cells in various groups determined by qRTPCR method(n＝3，）

*P＜0.05，**P＜0.01vscontrol blank group.

3 討論

圖6 Western blotting 法檢測(cè)各組H9C2 細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3 和Cleaved Caspase-9 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.6 Electrophoregram（A）and histogram（B）of expression levels of Bax，Bcl-2，Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9 proteins in H9C2 cells in various groups determined by Western blotting method

蒽環(huán)類藥物引起的心臟毒性具有累積性和劑量依賴性。2011 年中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）專家共識(shí)［6］指出：給予蒽環(huán)類藥物6 年后超過(guò)50%的患者可發(fā)生左心室組織和功能亞臨床心臟超聲變化。氧化應(yīng)激是目前公認(rèn)的蒽環(huán)類藥物引起心臟損傷的機(jī)制［7］。蒽環(huán)類藥物易聚集于心肌細(xì)胞的線粒體中，其醌基結(jié)構(gòu)在代謝過(guò)程中可循環(huán)生成許多ROS，促使心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死［8-12］。此外，蒽環(huán)類藥物還可以螯合鐵離子后觸發(fā)氧自由基的生成，引起心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化和心肌線粒體DNA 損傷［13-15］。另外，鈣蓄積、心肌細(xì)胞凋亡的觸發(fā)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白生長(zhǎng)因子1（neuregulin-1，NRG-1）/ErbB 信號(hào)通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)通路、β 腎上腺素受體（β-adrenergic receptor，βAR）和Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）等也參與蒽環(huán)類藥物相關(guān)心臟毒性發(fā)病機(jī)制［16］。

目前，蒽環(huán)類藥物心臟毒性的預(yù)防和治療尚缺乏令人滿意的方法，是國(guó)內(nèi)外的腫瘤心臟病學(xué)研究領(lǐng)域一個(gè)亟需解決的問(wèn)題。以DOX 制作實(shí)驗(yàn)性心肌損傷的細(xì)胞和動(dòng)物模型為目前研究心臟毒性常用的途徑與手段，這些模型制備方式因具有操作簡(jiǎn)單和費(fèi)用低等特點(diǎn)而逐漸在基礎(chǔ)研究中得到推廣和應(yīng)用［17］。但以DOX 誘導(dǎo)細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌損傷模型會(huì)出現(xiàn)較高的死亡率，DOX 誘導(dǎo)心肌損傷大鼠的死亡率高達(dá)30% 以上，給研究造成了極大困擾［18］。并且，由于DOX 的不良反應(yīng)較為嚴(yán)重，臨床上已經(jīng)不再使用DOX 作為腫瘤患者的一線化療藥物。因此，尋找一種誘導(dǎo)成功率高、細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的死亡率低且與臨床上實(shí)際用藥相結(jié)合的制備心肌損傷模型的方式為目前關(guān)注的重點(diǎn)。本研究采用的造模藥物為THP，是一種蒽環(huán)類藥物，其所致心臟毒性等不良反應(yīng)少于其他蒽環(huán)類藥物，在臨床中應(yīng)用較為廣泛，具有較實(shí)際的研究?jī)r(jià)值。

本研究采用CCK-8 法篩選出THP 制備H9C2損傷模型的作用最佳時(shí)間（24 h）和濃度范圍（1～10 μmol·L－1）。當(dāng)THP 濃度為1 μmol·L－1時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞中MDA 水平，SOD 和LDH 活性，細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 mRNA 表達(dá)水平及Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)水平變化不明顯，提示THP 濃度在低于1 μmol·L－1時(shí)引起H9C2 損傷程度過(guò)低，達(dá)不到實(shí)驗(yàn)造模要求；隨著給藥濃度的升高，當(dāng)THP濃度為9 μmol·L－1時(shí)，細(xì)胞損傷程度過(guò)重，細(xì)胞變形嚴(yán)重，全部凋亡甚至死亡，提示THP 濃度過(guò)高也會(huì)對(duì)H9C2 損傷模型制備造成影響，不符合實(shí)驗(yàn)造模要求。而THP 濃度為5 μmol·L－1時(shí)，細(xì)胞形態(tài)趨于正常并未發(fā)生嚴(yán)重變形，細(xì)胞中ROS 水平升高，細(xì)胞凋亡率為40%，各項(xiàng)指標(biāo)也符合實(shí)驗(yàn)要求，若增加保護(hù)心肌細(xì)胞損傷的藥物或方法等有益干預(yù)，能夠達(dá)到改善H9C2 造模后的損傷程度，可視為造模成功［19］。根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)指標(biāo)和細(xì)胞中MDA 水平、SOD 和LDH 活性、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)因子mRNA 和蛋白表達(dá)水平等實(shí)驗(yàn)指標(biāo)最終確定5 μmol·L－1THP 作為大鼠心肌細(xì)胞H9C2 損傷模型的最佳造模藥物濃度。

綜上所述，本研究所確定的造模藥物濃度和時(shí)間僅針對(duì)研究中所提及的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件，但對(duì)其他類似的實(shí)驗(yàn)條件也具有參考價(jià)值。在選取心肌細(xì)胞損傷模型時(shí)，還需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，模型藥物試劑的安全性、可重復(fù)性、有效性以及細(xì)胞凋亡時(shí)間、細(xì)胞活力和實(shí)驗(yàn)細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo)的時(shí)間等綜合考慮，盡量避免模型中試劑所引起的干擾，根據(jù)實(shí)際情況，選擇合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>