LncRNA MALAT1通過miR-34c/SATB2軸對脂肪間充質干細胞成骨分化的促進作用

郭瑋瑋,秦悅,楊海波,米占虎

（寧夏醫科大學總醫院創傷骨科,寧夏 銀川 750001）

脂肪間充質干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有自我更新和多向分化潛能，可用于再生或修復骨組織［1］。與骨髓來源的間充質干細胞比較，ADSCs 組織來源更豐富，細胞增殖速度更快［2］。然而，盡管有大量研究ADSCs 可分化為多種譜系，但ADSCs 分化的分子機制仍不明了。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）和微小RNA（miRNA）在成骨細胞分化中起關鍵作用［3-4］。研究［5］表明：LncRNAKCNQ1OT1 通過激活Wnt/β-catenin 通路促進成骨分化以減弱骨溶解。LncRNA H19 的異常表達與成骨分化有關［6］。細胞實驗［7］表明：LncRNA 肺癌轉移相關轉錄本1（metastasis-associated lung ademocarcinoma transcript 1，MALAT1）通過抑制miR-204 的表達，促進成骨細胞特異性標志物堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣蛋白（OCN）和礦化的骨基質形成。研究［8］表明：miRNA 參與調節成骨細胞和破骨細胞分化過程。miR-34c 通過調節成骨細胞中特異AT 序列結合蛋白2（special AT-rich sequence binding protein 2，SATB2）和Runt 相關轉錄因子2（Runx2）等多個靶點，影響成骨細胞和破骨細胞在體內的骨穩態［9］。過表達SATB2可以促進乙醇誘導的骨壞死患者骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs）的成骨分化［10］。目前，LncRNA MALAT1 在ADSCs 成骨分化中的作用尚不清楚。本研究旨在探討LncRNA MALAT1 通過miR-34c/SATB2 軸在ADSCs 成骨分化中的作用，以期為明確LncRNA MALAT1 調控ADSCs 成骨分化的機制和骨損傷的治療提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器原代人ADSCs 購自美國ScienCell 公司，HEK-293T 細胞購自中國典型培養物保藏中心。DMEM培養基購自美國Hyclone公司，胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司，青鏈霉素混合液（100×）購自北京索萊寶科技有限公司，Lipofectamine 3000 轉染試劑購自美國Invitrogen 公司，SYBRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaTa 公司，BCA 蛋白定量試劑盒購自北京全式金公司，lentiviral-pEF-1a/Puro-NC（Lenti-NC）、lentiviral-pEF-1a/Puro-MALAT1（Lenti-MALAT1）、lentiviral-pEF-1a/Puro-SATB2（Lenti-SATB2）、lentiviralpGLVU6/Puro-sh-NC（sh-NC）、lentiviralpGLVU6/Puro-sh-MALAT1（sh-MALAT1）、miR-NC 和miR-34c mimic（miR-34c）均購自上海GenePharma 公司，油紅O 和茜素紅購自美國Sigma 公司，FITC-CD44 抗體、FITCCD29 抗體、PE-CD90 抗體、PE-CD105 抗體和PE-vWF 抗體購自美國BD 公司，Runx2 抗體、OPN 抗體和OCN 抗體購自英國Abcam 公司。倒置相差顯微鏡購自日本Nikon 公司，實時熒光定量PCR 儀購自瑞士Roche 公司，微量分光光度計購自美國Thermo Scientific 公司。

1.2 細胞培養ADSCs 和HEK-293T 細胞用含10% FBS、100 IU·mL－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的DMEM 培養基中，于37℃、5% CO2條件下培養。

1.3 成骨細胞分化誘導誘導ADSCs 成骨分化：當ADSCs 長至80%～90%密度時，將培養基替換為成骨細胞特異性誘導培養基（含10%FBS，10 mmol·L－1β-甘油磷酸鈉，0.1μmol·L－1地塞米松和0.2 mmol·L－1抗壞血酸磷酸的低糖DMEM），每2 d 更換1 次培養基，于37℃、5%CO2條件下培養0、3、7、14 和21 d。誘導ADSCs成脂分化：當ADSCs 長至80%～90%密度時，將培養基替換為成脂細胞特異性誘導培養基（含10%FBS，10 mmol·L－1β-甘油磷酸鈉，1 μmol·L－1地塞米松，0.5 mmol·L－13-異丁基-1-甲基黃嘌呤，10 μmol·L－1胰島素和200 μmol·L－1吲哚美辛的低糖DMEM），每2d更換1 次培養基，于37℃、5%CO2條件下培養14 d。

1.4 免疫熒光染色檢測ADSCs 中CD44、CD29、CD90、CD105 和vWF表達ADSCs 成骨誘導培養基培養21d后，棄去細胞培養基，PBS 緩沖液清洗后，4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100 穿透，10%脫脂奶粉封閉，FITC-CD44 抗體（1∶200）、FITC-CD29 抗體（1 ∶200）、PE-CD90 抗體（1 ∶200）、PE-CD105抗體（1∶200）和PE-vWF 抗體（1∶200）避光孵育2h，DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察細胞發光情況。

1.5 油紅O 染色法檢測細胞脂滴形成ADSCs 棄去成脂誘導培養基，PBS 緩沖液清洗后，4%多聚甲醛固定。PBS 緩沖液清洗細胞后，0.3%油紅O室溫染色20 min。棄去染液，蒸餾水洗滌后，顯微鏡觀察并拍照。

1.6 ADSCs 中ALP 水平檢測ADSCs 棄去成骨誘導培養基，根據BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒說明書檢測細胞中ALP 水平，酶標儀405 nm 處檢測各組細胞吸光度（A）值，對ALP水平進行定量。計算公式：ALP 水平＝［（樣品組A 值－空白組A 值）－（對照組A 值－空白組A值）］/（對照組A 值－空白組A 值）。

1.7 RT-PCR 法檢測ADSCs 中miR-34c 表達和LncRNA MALAT1、SATB2、Runx2、OPN 及OCN mRNA 表達水平收集轉染后的ADSCs，TRIzol法提取樣品中的總RNA，分光光度計測定RNA 濃度，逆轉錄合成cDNA。按照SYBRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行RT-PCR 法檢測。反應條件：95℃、30 s；95℃、5 s，58℃、30 s，40 個循環；95℃、15 s，58℃、30 s，95℃、15 s。以U6和GAPDH 為內參，采用2－ΔΔCt法計算miR-34c 表達水平和LncRNA MALAT1、SATB2、Runx2、OPN及OCN mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 RT-PCR 法引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR method

1.8 細胞轉染成骨誘導后的ADSCs 或293T 細胞接種于6 孔細胞培養板，每孔4×105個細胞，待細胞密度達到60%～70% 時，按照Lipofectamine 3000 說明書進行miR-34c 和miR-NC 的轉染，終濃度均為60 nmol·L－1。37℃、5%CO2條件下培養48 h。ADSCs 轉染慢病毒時，將細胞培養液更換為含6 mg·L－1聚凝胺和感染復數（MOI）＝20 的lentiviral-pEF-1a/Puro-NC（Lenti-NC）、lentiviralpEF-1a/Puro-MALAT1（Lenti-MALAT1）、lentiviral-pEF-1a/Puro-SATB2（Lenti-SATB2）、lentiviralpGLVU6/Puro-sh-NC（sh-NC）和lentiviralpGLVU6/Puro-sh-MALAT1（sh-MALAT1）慢病毒的新鮮培養基，37℃、5%CO2條件下培養48 h。

1.9 熒光素酶報告實驗檢測LncRNA MALAT1與miR-34c 和miR-34c 與SATB2 之間的靶向結合作用miRcode（http：//www.miRcode.org/）預測MALAT1 與 miR-34c 的靶向結合位點，TargetScan 7.1（http：//www.TargetScan.org/vert_/）預測miR-34c 和SATB2 之間的靶向結合位點。針對LncRNA MALAT1 3'-UTR 端和SATB2 3'-UTR 端序列構建野生型（WT）和突變型（MUT）報告基因質粒。參照“1.8”步驟，將MALAT1-WT 和MALAT1-MUT（或SATB2-WT 和SATB2-MUT）分別與miR-NC 和miR-34c共同轉染至HEK-293T 細胞中，48 h 后檢測熒光素酶活性。

1.10 茜素紅S（ARS）染色檢測細胞鈣鹽沉積棄去ADSCs 成骨誘導培養基，PBS 緩沖液清洗后，4% 多聚甲醛固定。PBS 緩沖液清洗細胞后，0.1%ARS 染色液室溫孵育20 min。棄去染液，蒸餾水洗滌。為了定量鈣鹽沉積，向細胞中加入含有10 mmol·L－1磷酸鈉的10%氯化十六烷基吡啶，并用酶標儀檢測各樣品在562 nm 處的A 值。ARS 水平＝［（樣品組A 值－空白組A 值）－（對照組A 值－空白組A 值）］/（對照組值－空白組A 值）。

1.11 Western blotting 法檢測細胞中Runx2、OPN 和OCN 蛋白表達水平收集轉染后的ADSCs 或293T 細胞，BCA 法測定蛋白濃度，取30 μg 蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，并將其轉至PVDF 膜上。10%脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入Runx2（1∶1 500）、OPN（1∶1 000）、OCN（1 ∶2 000）和GAPDH（1 ∶2 000），4℃孵育過夜。HRP 標記二抗（1∶2 500）室溫孵育1 h 后，ECL 發光、曝光。Image J 分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH 條帶灰度值比值表示目的蛋白表達水平。

1.12 統計學分析采用SPSS 21.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞中熒光素酶活性，LncRNA MALAT1、miR-34、SATB2、Runx2、OPN 和OCN 表達水平，ALP 和ARS 水平均以表示，2 組間樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADSCs 的特征和多能分化潛能的鑒定ADSCs 中間充質干細胞標記物CD29、CD90、CD44 和CD105 呈陽性表達，而內皮細胞標記物vWF 呈陰性表達（圖1A～F）；同時細胞具有長絲狀結構（圖2A），表明該細胞是ADSCs。油紅O 染色法和ALP 染色檢測結果顯示：在成脂或成骨誘導條件下，ADSCs 中有紅色脂滴形成（圖2B）和橘紅色鈣鹽沉積（圖2C）。

2.2 ADSCs 成骨分化過程中LncRNA MALAT1、miR-34c、SATB2、Runx2、OPN 及OCN mRNA 表達水平與第0 天比較，ADSCs 成骨誘導第3、7、14 和21 天后細胞中LncRNA MALAT1 和SATB2及成骨標記物Runx2、OPN 和OCN mRNA 表達水平均明顯升高（P＜0.05），miR-34c mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

2.3 各組細胞中LncRNA MALAT1、Runx2、OPN 和OCN蛋白表達水平及ALP 和ARS 水平與Lenti-NC 組比較，Lenti-MALAT1 組ADSCs 中Runx2、OPN 和OCN 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），見圖4A，LncRNA MALAT1 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），見圖4B，ALP 和ARS 活水平明顯升高（P＜0.01），見圖5和圖6；與sh-NC 組比較，sh-MALAT1 組ADSCs 中Runx2、OPN 和OCN 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），見圖4A，MALAT1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），見圖4B，ALP 和ARS 水平明顯降低（P＜0.01），見圖5和圖6。

2.4 熒光素酶報告實驗中各組 ADSCs 中miR-34c、Runx2、OPN 和OCN 表達水平及ALP 和ARS 水平LncrRNA MALAT1 與miR-34c 結合位點見圖7A。熒光素酶報告實驗結果顯示：與miRNC 組比較，miR-34c 轉染后MALAT1-WT 組熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01），MALAT1-MUT組熒光素酶活性差異無統計學意義（P＞0.05，見圖7B）。與miR-NC+Lenti-NC 組比較，miR-34c+Lenti-NC 組ADSCs 中miR-34c 表達水平明顯升高（P＜0.01，見圖7C），LncRNA MALAT1 表達水平明顯降低（P＜0.05，見圖7C），Runx2、OPN和OCN 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），見圖8，ALP 和ARS 水平明顯降低（P＜0.01，見圖9和圖10，miR-34c+Lenti-MALAT1 組ADSCs 中miR-34c、MALAT1 表達水平及Runx2、OPN 和OCN 表達水平，ALP 和ARS 水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 成骨分化過程中ADSCs 中LncRNA MALAT1（A）、miR-34c（B）、SATB2（C）、OPN（D）、OCN（E）和Runx2（F）mRNA表達水平Fig.3 Expression levels of LncRNA MALAT1（A），miR-34c（B），SATB2（C），OPN（D），OCN（E），and Runx2（F）mRNA in ADSCs during osteogenie differentiation

圖4 各組ADSCs 中LncRNA MALAT1、Runx2、OPN 和OCN 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B,C）Fig.4 Electrophoregram（A）and histogram（B，C）of expressions of MALAT1，Runx2，OPN and OCN proteins in ADSCs in various groups

2.5 miR-34c 與SATB2 結合位點和靶向結合及LncRNA MALAT1、miR-34c 和SATB2 表達水平miR-34c 與SATB2 結合位點見圖11A。熒光素酶報告實驗結果顯示：與miR-NC 組比較，miR-34c 轉染后SATB2-WT 組熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01），SATB2-MUT 組熒光素酶活性差異無統計學意義（P＞0.05），見圖11B；與miR-NC+Lenti-NC 組比較，miR-NC+Lenti-SATB2 組ADSCs 中SATB2 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01），見圖11C；Runx2、OPN 和OCN 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），見圖12；ALP 和ARS水平明顯升高（P＜0.01），見圖13和圖14；miR-34c+Lenti-SATB2組LncRNAMALAT1表達水平明顯降低（P＜0.05），miR-34c 表達水平明顯升高（P＜0.01），見圖 11C；SATB2、Runx2、OPN 和OCN 蛋白表達水平及ALP 和ARS水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖6 各組ADSCs 中ALP 和ARS 水平Fig.6 Levels of ALP and ARS in ADSCs in various groups

3 討論

ADSCs 是位于脂肪組織中的再生細胞，具有多向分化潛能［11］。ADSCs 可通過脂肪細胞置換促進組織新陳代謝和血管生成［12］。BMSCs 是骨再生的細胞來源，最近研究［13］表明： BMSCs 的增殖能力和成骨分化能力隨年齡和骨質疏松程度的增加而降低，而ADSCs 在老年和骨質疏松情況下成骨分化能力不變。因此，ADSCs 成骨分化機制受到越來越多的關注。LncRNAs 是一種轉錄本長度超過200nt 的非編碼RNA，參與多種生物學過程，包括表觀遺傳調控、RNA衰變、細胞分化和轉錄［14］。研究［15］表明：LncRNA 在調節骨骼系統相關的生物學活性方面（骨質疏松癥和骨關節炎）具有重要作用。LncRNA MALAT1 通過調節miR-214/ATF4 軸促進成骨分化［16］。

圖7 miRcode、熒光素酶報告實驗和RT-PCR 法檢測各組細胞中miR-34c 和LncRNA MALAT1 的靶向結合（A）及各組細胞中熒光素酶活性、miR-34c 和MALAT1 mRNA 表達水平（B，C）Fig.7 Targeted binding of miR-34c and MALAT1（A）and activities of luciferase expression levels of miR-34c and LncRNA MALAT1 in cells in various groups（B，C）detected by miRcode，luciferase report experiment and RT-PCR methods

圖8 Western blotting 法檢測共轉染組ADSCs 中Runx2、OPN 和OCN 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.8 Electrophoregram（A）and histogram（B）of expressions of Runx2，OPN and OCN proteins in ADSCs in co-transfection groups detected by Western blotting method

圖10 共轉染組ADSCs 中ALP 和ARS 水平Fig.10 Levels of ALP and ARS in ADSCs in cotransfection groups

研究［17］表明：LncRNA 在成骨-成脂譜系中起表觀遺傳調控作用。LncRNA MIAT1 促進ADSCs的成骨分化并逆轉炎癥的不良反應［18］。本研究結果顯示：在ADSCs 成骨分化過程中，MALAT1 的表達水平升高，MALAT1 正向調控ADSCs 成骨分化，這與之前的研究結果一致。研究［19］表明：miRNA 參與調節成骨細胞和破骨細胞分化過程，如miR-221-5p 通過靶向smad3 抑制BMSCs 成骨分化；miRNA-429 通過靶向SCD-1 抑制氧化應激下人BMSCs的成骨分化［20］。lncRNA 和miRNA 間 的相互作用參與成骨分化過程，GAO等［21］研究表明：骨質疏松患者的BMSCs 中MALAT1 表達水平明顯降低，成骨誘導BMSCs 后MALAT1 表達水平升高。敲除MALAT1 則抑制BMSCs 的成骨分化，MALAT1 通過靶向miR-143 促進BMSCs 的成骨分化；lncRNA TUG1 通過使miR-204-5p 海綿化而促進成骨細胞的分化，從而導致Runx2 表達上調［22］。LncRNA MEG3 通過靶向miR-133a-3p 抑制BMSCs 的成骨分化［23］。本研究結果顯示：在ADSCs 成骨分化過程中，miR-34c 與MALAT1 間存在相互調控作用，MALAT1 通過靶向抑制miR-34c 的表達促進ADSCs 成骨分化。

SATB2 是成骨細胞分化的特異性免疫組織化學生物標記物，對骨和軟組織腫瘤發揮重要作用［24］。研究［25］表明：許多特異性miRNAs 通過轉化生長因子β（TGF-β）/骨形態發生蛋白（BMP）信號途徑參與SATB2 誘導的早期成骨分化。miR-34b/c 靶向調控SATB2［26-27］。miR-383 通過靶向SATB2 負調控大鼠BMSCs 的成骨細胞分化［28］。本研究結果顯示：SATB2 可促進ADSCs 成骨分化，miR-34c 通過靶向SATB2 負調控ADSCs 成骨分化。

綜上所述，LncRNA MALAT1 通過microRNA-34c/SATB2 軸促進ADSCs 的成骨分化。本研究結果為探究lncRNA 調控ADSCs 成骨分化的機制和骨損傷的治療提供了新的科學依據。

圖11 miR-34c 與SATB2 結合位點和靶向結合(A)及各組細胞中LncRNA MALAT1、miR-34c和SATB2 mRNA表達水平(B,C)Fig.11 Binding sites of miR-34c and SATB2 and targeted binding（A）and expression levels of LncRNA MALAT1，miR-34c and SATB2 mRNA in cells in various groups（B，C）

圖12 Western blotting 法檢測各組ADSCs 中Runx2、OPN 和OCN 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.12 Electrophoregram（A）and histogram（B）of expressions of Runx2，OPN and OCN proteins in ADSCs in various groups detected by Western blotting method

圖14 各組ADSCs 中ALP 和ARS 水平Fig.14 Levels of ALP and ARS in ADSCs in various groups