丹參多酚酸對心房顫動大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1水平及ERK1/2-NF-κB 信號通路的影響

李小兵 ,王旭 ,呂瑛,黃建成,李紅英,王軍，張會軍,蘇振宇

（1.河北醫科大學第一醫院放射科，河北 石家莊 050031；2.河北醫科大學第一醫院心臟外科，河北 石家莊 050031）

心房顫動（房顫）為臨床上常見的心律失常之一，房顫患者常并發腎功能障礙和腦卒中等嚴重疾病，給患者、家庭和社會帶來沉重負擔。房顫病因尚不十分清楚，近年來，炎癥反應與房顫的關系受到研究者的關注。研究［1-3］顯示：房顫心肌組織中有多種炎癥細胞浸潤，表明炎癥反應在房顫的疾病發生發展過程中發揮重要作用，抑制炎癥反應可降低房顫的發病風險。丹參多酚酸為中藥丹參水溶性活性成分，具有抑制血管損傷、抗心肌缺血、抗炎癥反應和減輕鈣超載等作用［4-5］。研究［6］顯示：丹參多酚酸可通過降低心肌細胞重構過程改善房顫大鼠的心肌損傷程度，從而發揮治療房顫的作用。丹參多酚酸還可以通過抑制炎癥反應發揮對多種疾病的治療作用，如其可通過抑制機體微炎癥狀態發揮對糖尿病腎病的治療作用［7］，通過抑制炎癥反應改善不穩定型心絞痛的心功能［8］。但有關丹參多酚酸治療房顫機制方面的研究尚未見相關報道，本研究通過分析丹參多酚酸對房顫大鼠心肌組織炎癥反應和細胞外信號調節酶1/2-核轉錄因子-κB（extracellular signal-regulating enzymes 1/2-nuclear transcription factor-κB，ERK1/2-NF-κB）信號通路的影響，探討丹參多酚酸是否通過抗炎作用發揮其對房顫的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器清潔級健康雄性SD 大鼠48 只，12 周齡，體質量200～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2014-001。注射用丹參多酚酸鹽（規格：每瓶50 mg，批號：20190523，上海綠谷制藥有限公司），蘇木精-伊紅（HE）染液（美國Sigma 公司），RIPA 裂解液、Masson 試劑盒、免疫組織化學試劑盒、兔抗鼠基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）多克隆抗體、兔抗鼠基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）多克隆抗體、兔抗鼠血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）多克隆抗體、兔抗鼠細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）多克隆抗體、兔抗鼠ERK1/2 多克隆抗體、兔抗鼠磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）多克隆抗體、兔抗鼠NFκB 多克隆抗體和兔抗鼠磷酸化NF-κB（p-NF-κB）多克隆抗體（美國Abcam 公司）。TGL-16M 高速離心機（湖南長沙湘儀儀器廠），EN61010-1 水平電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 實驗動物模型建立、分組及給藥方式將48 只大鼠隨機分為對照組、房顫組和丹參多酚酸組，每組16 只。房顫模型建立：除對照組外，房顫組和丹參多酚酸組大鼠建立房顫模型［9］，行刺激前先描記各大鼠心電圖，然后舌下靜脈注射氯化鈣、乙酰膽堿混合液（1 mL·kg－1），再次描記大鼠心電圖，待出現典型的房顫f 波；隔日進行1 次，共4 周。造模成功標準：停藥后心電圖仍有典型的房顫波改變。建模成功后，丹參多酚酸組大鼠采用丹參多酚酸注射液（4 mg·kg－1·d－1）灌胃［10］，對照組和房顫組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，每天1 次，共4 周。

1.3 實驗動物取材治療結束后處死大鼠，取心肌組織，將其分為2 份：一份心肌組織經多聚甲醛固定72 h，常規脫水、石蠟包埋，用于HE 染色、Masson 染色和免疫組織化學染色；一份心肌組織用于Western blotting 法測定。

1.4 HE染色觀察大鼠心肌組織病理形態表現將石蠟切片烤片30 min，常規脫蠟，蘇木精染色7 min，自來水沖洗，稀鹽酸反應數秒，自來水沖洗，氨水返藍，自來水沖洗，伊紅染色，水洗，脫水透明，顯微鏡下觀察大鼠心房組織病理形態表現。

1.5 Masson染色觀察各組大鼠心肌纖維化情況將心肌組織石蠟切片脫蠟至水，蘇木精染色10 min，鹽酸乙醇分化，比布列猩紅水-酸性品紅-冰乙酸溶液染色2 min，磷鉬酸-磷鎢酸溶液染色15 min，苯胺藍-冰乙酸溶液染色5 min，乙酸溶液浸洗5 min，常規脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察大鼠心肌纖維化情況。

1.6 免疫組織化學染色檢測各組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平將心肌組織石蠟切片常規脫蠟至水，加入H2O2室溫靜置10 min，PBS 緩沖液沖洗，山羊血清封閉液封閉20 min，加入一抗兔抗鼠MMP-2 多克隆抗體和兔抗鼠MMP-9多克隆抗體孵育過夜，PBS 緩沖液沖洗，加入二抗孵育1 h，PBS 緩沖液沖洗，加入鏈霉素和過氧化物酶孵育30 min，PBS 緩沖液沖洗，DAB 顯色劑顯色，自來水沖洗，復染，脫水，透明，封片。采用BioMias 2000 圖像處理分析軟件進行MMP-2 和MMP-9 蛋白陽性染色面積和積分光密度值測定。以積分光密度值代表蛋白表達水平。積分光密度＝平均光密度×蛋白陽性染色面積。

1.7 Western blotting 法測定各組大鼠心肌組織中VCAM-1、ICAM-1、ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白水平取心肌組織50 mg，加入裂解液提取總蛋白，煮沸表型，經電泳、轉膜和封閉后，加入一抗：兔抗鼠VCAM-1 多克隆抗體、兔抗鼠ICAM-1 多克隆抗體、兔抗鼠ERK1/2 多克隆抗體、兔抗鼠p-ERK1/2 多克隆抗體、兔抗鼠NFκB 多克隆抗體和兔抗鼠p-NF-κB 多克隆抗體，孵育過夜，加入二抗孵育2 h，采用Image lab software 軟件采集條帶灰度值，以β-actin 為內參。目標蛋白表達水平＝目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8 統計學分析采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 積分光密度值以及VCAM-1、ICAM-1、ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平相關性分析采用Pearson 相關分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物模型的建立停藥后大鼠心電圖仍有典型的房顫波改變，表明大鼠房顫模型建立成功。見圖1。

圖1 房顫模型大鼠造模前后ECG 表現Fig.1 ECG performance of atrial fibrillation model rats before and after modeling

2.2 各組大鼠心肌組織病理形態表現對照組大鼠心肌細胞未見明顯異常；房顫組大鼠心肌細胞排列紊亂，心肌組織間質增多，可見炎性細胞浸潤；與房顫組比較，丹參多酚酸組大鼠心肌細胞排列尚正常，心肌組織間質稍多，炎性細胞浸潤不明顯。見圖2。

2.3 各組大鼠心肌纖維化情況對照組大鼠心肌間質膠原纖維正常；房顫組大鼠心肌間質膠原纖維明顯增多；與房顫組比較，丹參多酚酸組大鼠心肌間質膠原纖維較房顫組明顯減少。見圖3。

2.4 各組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與對照組比較，房顫組和丹參多酚酸組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與房顫組比較，丹參多酚酸組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表1 和圖4。

表1 各組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of MMP-2 and MMP-9 in myocardium tissue of rats in various groups（n＝16，）

表1 各組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of MMP-2 and MMP-9 in myocardium tissue of rats in various groups（n＝16，）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with atrial fibrillation group.

2.5 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平與對照組比較，房顫組和丹參多酚酸組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與房顫組比較，丹參多酚酸組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見圖5 和表2。

圖5 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of VCAM-1 and ICAM-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

表2 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝16,）

表2 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝16,）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with atrial fibrillation group.

2.6 各組大鼠心肌組織中ERK1/2-NF-κB 信號通路相關蛋白表達水平各組大鼠心肌組織中ERK1/2 和NF-κB 蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與對照組比較，房顫組和丹參多酚酸組大鼠心肌組織中p-ERK1/2 和p-NF-κB 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與房顫組比較，丹參多酚酸組大鼠心肌組織中p-ERK1/2 和p-NF-κB蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見表3 和圖6。

表3 各組大鼠心肌組織中ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of ERK1/2,p-ERK1/2,NF-κB,and p-NF-κB proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝16,）

表3 各組大鼠心肌組織中ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of ERK1/2,p-ERK1/2,NF-κB,and p-NF-κB proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝16,）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with atrial fibrillation group.

圖6 各組大鼠心肌組織中ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達電泳圖Fig.6 Electrophoregram of ERK1/2，p-ERK1/2，NF-κB，and p-NF-κB proteins in myocardium tissue of rats in various groups

2.7 房顫組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平相關性分析房顫組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平呈正相關關系（P＜0.01）。見表4。

表4 房顫組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平相關性Tab.4 Correlations between MMP-2 and MMP-9 protein expression levels and VCAM-1 and ICAM-1 protein expression levels in myocardium tissue of rats in atrial fibrillation group

3 討論

本研究中房顫組大鼠心肌組織中VCAM-1、ICAM-1、p-ERK1/2 和p-NF-κB 蛋白表達水平升高，表明房顫大鼠心肌組織存在炎癥反應，且ERK1/2-NF-κB 信號通路激活。房顫患者或動物模型中多種炎癥細胞因子水平升高。VCAM-1 和ICAM-1 為膜表面糖蛋白，是介導細胞與細胞之間以及細胞與細胞外基質之間相互黏附、結合的黏附分子，VCAM-1 和ICAM-1 為體內重要的炎癥因子。在多數單核細胞膜上均存在VCAM-1 受體，VCAM-1 主要發揮促進單個核細胞黏附作用；ICAM-1 可介導細胞間識別，直接誘導白細胞聚集［11］。在白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等多種炎癥介質的作用下，VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平升高［12］。在房顫時大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平升高，其通過介導炎癥反應引起心房組織結構改變，從而導致房顫的發生［13-14］。ERK1/2-NF-κB 信號通路在炎癥反應中發揮重要作用，在多種因素作用下，ERK1/2 發生磷酸化，進而被激活，由細胞質轉位到細胞核，進一步介導NF-κB 磷酸化，p-NF-κB 被進一步激活，促進炎性細胞活化，參與機體炎癥反應［15-16］。NF-κB 的靶基因眾多，其靶基因（包括多種炎癥細胞因子）均含有與NF-κB 結合的位點，VCAM-1和ICAM-1 序列中均含有NF-κB 結合位點，故VCAM-1 和ICAM-1的表達水平受NF-κB 調控，NF-κB 信號通路激活可促進VCAM-1 和ICAM-1 水平升高［17-18］。故激活的ERK1/2-NF-κB 信號通路通過調控VCAM-1 和ICAM-1 炎癥因子水平參與房顫的發生和維持。丹參多酚酸具有抗炎作用［19-20］，本研究結果顯示：丹參多酚酸治療后房顫大鼠心肌組織中VCAM-1、ICAM-1、p-ERK1/2 和p-NF-κB蛋白表達水平降低，表明丹參多酚酸可能通過抑制ERK1/2-NF-κB 信號通路激活，從而下調VCAM-1和ICAM-1 炎癥因子水平，發揮對房顫的治療作用。

本研究中房顫大鼠心肌組織中有炎癥細胞浸潤，可見大量膠原沉積，心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平升高。心肌纖維化為房顫心房結構重構的重要特征，心肌纖維化主要表現為心肌細胞外基質重構。心肌細胞外基質的主要成分為膠原蛋白，當受到異常刺激時心肌成纖維細胞大量合成和分泌膠原，導致細胞外基質中的膠原過量沉積，最終引起心肌纖維化，心肌纖維化對心房組織結構和功能造成破壞，使房顫更容易發生和維持［21］。MMPs 在維持心肌細胞外基質的合成和降解中發揮重要作用，MMP-2 和MMP-9 為2 種常用的MMPs，在心肌纖維化中發揮重要作用；正常情況下，MMP-2 和MMP-9 在細胞中以酶原形式存在，房顫早期細胞內存在鈣超載，并可引起一系列病理生理變化，誘導MMP-2 和MMP-9 的分泌和活化，導致MMP-2 和MMP-9 活性增加，表達水平升高，引起正常的細胞外基質成分降解，同時合成不具有正常結構和功能的結締組織和膠原蛋白，引起心肌組織重塑，導致房顫的發生發展［22］。故在房顫早期，細胞內鈣超載誘導MMP-2 和MMP-9分泌和活化，導致心肌組織不具有正常結構和功能的結締組織和膠原蛋白增加，從而發生心肌重構，引起房顫的發生。MMPs 與VCAM-1 和ICAM-1 分子共同參與多種疾病的發生發展，在房顫發病過程中MMPs 與VCAM-1 和ICAM-1 相互作用參與房顫的發生發展［23-24］。本研究結果顯示：房顫組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平呈正相關關系；丹參多酚酸可降低房顫大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平。VCAM-1 和ICAM-1 作為炎癥因子，通過影響MMP-2 和MMP-9 水平，引起房顫大鼠心肌纖維化，導致房顫發生；丹參多酚酸通過抑制炎癥反應，降低炎癥因子VCAM-1 和ICAM-1 水平，從而降低MMP-2 和MMP-9 水平，抑制心肌重構，阻止房顫的發生發展。

綜上所述，丹參多酚酸治療房顫可能是通過其抑制ERK1/2-NF-κB 信號通路激活，下調其靶基因VCAM-1 和ICAM-1 炎癥因子水平，影響MMP-2和MMP-9 表達，從而抑制房顫心肌纖維化，發揮對房顫的治療作用。