LncRNA CCAT1 通過TGF-β/Smad 信號通路對子宮內膜癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響

魏旭靜,李林,張紅真,王景,徐靜

（河北醫科大學第一醫院產科，河北 石家莊 050000）

子宮內膜癌是女性常見的惡性腫瘤，其發病機制復雜，探討其發生發展機制對其診治及改善其預后具有重要價值。近年來，子宮內膜癌細胞增殖、侵襲遷移及其分子機制方面的研究取得了巨大進步，長鏈非編碼核糖核酸（long non coding RNA，LncRNA）在胚胎發育、基因表達和腫瘤發生等過程中發揮重要作用，多種LncRNA 參與子宮內膜癌的發生發展過程［1］。近年來研究［2］發現：LncRNA CCAT1 在多種惡性腫瘤的增殖和侵襲遷移過程中發揮重要作用，在子宮內膜癌中的作用也受到研究者關注，YU 等［3］研究發現：LncRNA CCAT1 可促進子宮內膜癌細胞的增殖和遷移。但其通過何種信號通路在子宮內膜癌發生發展中發揮作用尚不清楚。轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad 信號通路參與子宮內膜癌的增殖及侵襲遷移過程，SAHOO 等［4］研究顯示：抑制細胞外基質介導的TGF-β 信號轉導可抑制子宮內膜癌的轉移。本實驗通過觀察沉默CCAT1 對子宮內膜癌細胞增殖、侵襲和遷移及TGF-β/Smad 信號通路的影響，探討其在子宮內膜癌中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人子宮內膜癌Ishiwaka 細胞株和正常人子宮內膜基質細胞THESC（中國科學院上海細胞庫）；Lipofectamine 2000 試劑盒（美國Invitrogen 公司），CCAT1 模擬物siRNA（CCAT1-siRNA）和陰性對照模擬物siRNA（廣州博銳生物科技公司），ECL 化學發光試劑盒、逆轉錄（RT）試劑盒、Trizol 試劑、聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒、LY364947（TGF-β/Smad 抑制劑）和結晶紫（美國Sigma 公司），CCK8 試劑、胰蛋白酶和DMEM 培養基（美國BPB 公司），兔抗人增殖細胞核抗原（PCNA）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、鋅指轉錄因子（snail）、凋亡抑制蛋白（Twist）、白細胞抑制因子2/3（Smad2/3）、磷酸化Smad 2/3（p-Smad2/3）、轉化生長因子β1（TGF-β1）和兔抗人TGF-β1 單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）；Multiskan?FC 酶標儀、Applied Biosystems PCR 儀和NERL?流式細胞儀（美國賽默飛世爾科技公司），Transwell 小室（美國TaKaRa 公司）等。

1.2 細胞培養Ishiwaka 細胞和T-HESC 細胞置于DMEM（含雙抗和10%胎牛血清）培養，細胞貼壁后每2 d 換液1 次，細胞生長至達80%以上融合時進行細胞傳代培養。

1.3 實時熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測Ishiwaka 細胞和T-HESC 細胞中CCAT1 mRNA 表達水平取Ishiwaka 和T-HESC 細胞，加入Trizol裂解液裂解細胞，提取細胞總RNA，將RNA 逆轉錄為cDNA，PCR 法檢測細胞中CCAT1 mRNA 表達水平；CCAT1上游引物：5'-CCATTCCATTCATTTCTCTTTCCTA-3'，下游引物：5'-GGCGTAGGCGATTGGGGATCG-3'。PCR 反應條件：95℃、30 s；95℃、5 s，58℃、30 s，72℃、30 s，共42 個循環。以U6 為內參照。每組設7 個復孔。以2－ΔΔCt法計算細胞中CCAT1 mRNA 表達水平。

1.4 細胞分組和轉染取對數生長期的Ishiwaka細胞分為空白對照組、陰性對照組、CCAT1-siRNA 組和CCAT1-siRNA+LY364947 組，將各組對數生長期的Ishiwaka 細胞接種到6 孔細胞培養板中，每孔2×105個細胞，培養至細胞達90%以上融合時進行轉染，陰性對照組轉染陰性對照siRNA，CCAT1-siRNA 組轉染CCAT1-siRNA，CCAT1-siRNA+LY364947 組轉染 CCAT1-siRNA 同時加入LY364947（3 μL）［5］，空白對照組不轉染。轉染步驟嚴格參照Lipofectamine 2000 試劑盒說明書進行。轉染24 h 后采用RT-PCR 法檢測細胞中CCAT1 mRNA 表達水平，方法同“1.2”。

1.5 CCK8 法檢測Ishiwaka 細胞增殖能力取各組生長良好的Ishiwaka 細胞接種到96 孔細胞培養板中，每孔5×103個細胞，培養24、48 和72 h 時每孔分別加入10 μL 的CCK8 試劑，繼續培養2 h，每組設7 個復孔。酶標儀檢測450 nm 波長處各孔吸光度（A）值，以A 值表示細胞增殖能力。

1.6 Transwell 小室實驗檢測各組侵襲細胞數和遷移細胞數取各組生長狀態良好的Ishiwaka 細胞用雙無培養基懸浮，將含血清的正常培養基加入24 孔細胞培養板中，將24 孔細胞培養板放入Transwell 小室，調整各組細胞個數，使200 μL 培養液中含5×104個細胞，將各組細胞放入Transwell 小室培養24 h，然后取出小室，甲醇固定30 min，棉簽擦去內室細胞，用 結晶紫染色30 min，纖維鏡下觀察遷移細胞數。侵襲實驗在實驗前用基質膠包被小室，其余步驟同遷移實驗。

1.7 Western blotting 法檢測Ishiwaka 細胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達水平取各組轉染24 h 細胞加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測細胞蛋白濃度。取100 μg 蛋白電泳，經轉膜、5% 脫脂奶粉封閉，加入一抗： 兔抗人PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 單克隆抗體，稀釋比例1：200，過夜孵育。加入二抗（1：5 000）孵育2 h，以β-actin 為內參，化學發光法顯色，每組設7 個復孔，凝膠電泳成像儀采集圖像，Quantity One 軟件分析條帶灰度值。目標蛋白表達水平=目標蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.8 統計學分析采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析。不同細胞中CCAT1 mRNA 表達水平、各組細胞增殖能力、遷移細胞數、侵襲細胞數以及細胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達水平經檢驗均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同細胞中 CCAT1mRNA 表達水平Ishiwaka 細胞中CCAT1 mRNA 表達水平（1.94±0.17）明顯高于T-HESC 細胞（1.00±0.09）（t=12.929，P＜0.01）。

2.2 各組Ishiwaka 細胞中CCAT1 mRNA 表達水平與空白對照組（1.00±0.08）和陰性對照組（0.99±0.10）比較，CCAT1-siRNA 組和CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細胞中CCAT1 mRNA 表達水平（0.52±0.06 和0.49±0.07）明顯降低（P＜0.01），空白對照組與陰性對照組及CCAT1-siRNA 組與CCAT1-siRNA +LY364947 組Ishiwaka 細胞中CCAT1 表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組Ishiwaka 細胞增殖能力培養24 h，各組Ishiwaka 細胞增殖能力比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；培養48 和72 h，與空白對照組和陰性對照組比較，CCAT1-siRNA組和CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細胞增殖能力明顯降低（P＜0.05），與 CCAT1-siRNA 組比較，CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細胞增殖能力明顯降低（P＜0.05），空白對照組與陰性對照組Ishiwaka 細胞比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組Ishiwaka 細胞增殖能力Tab.1 Proliferation rates of Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

表1 各組Ishiwaka 細胞增殖能力Tab.1 Proliferation rates of Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group；#P＜0.05 compared with CCAT1-siRNA group.

2.4 各組Ishiwaka 細胞中侵襲細胞數和遷移細胞數與空白對照組和陰性對照組比較，CCAT1-siRNA 組和 CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細胞中侵襲細胞數和遷移細胞數明顯降低（P＜0.05）；與CCAT1-siRNA 組比較，CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細胞侵襲細胞數和遷移細胞數明顯降低（P＜0.05），空白對照組與陰性對照組Ishiwaka 細胞中侵襲細胞數和遷移細胞數比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2、圖1和圖2。

表2 各組Ishiwaka 細胞中侵襲細胞數和遷移細胞數Tab.2 Number of invasion and migration cells in Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

表2 各組Ishiwaka 細胞中侵襲細胞數和遷移細胞數Tab.2 Number of invasion and migration cells in Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group；#P＜0.05 compared with CCAT1-siRNA group.

2.5 各組Ishiwaka 細胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail 和Twist 蛋白表達水平與空白對照組和陰性對照組比較，CCAT1-siRNA 組和CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細胞中PCNA、vimentin、snail 和Twist 蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與CCAT1-siRNA 組比較，CCAT1-siRNA+LY364947 組 Ishiwaka 細胞E-cadherin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），其他蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），但空白對照組與陰性對照組Ishiwaka 細胞中上述蛋白表達水平比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3和圖3。

表3 各組Ishiwaka 細胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail 和Twist 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of PCNA,E-cadherin,vimentin,snail and Twist proteins in Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

表3 各組Ishiwaka 細胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail 和Twist 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of PCNA,E-cadherin,vimentin,snail and Twist proteins in Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group；#P＜0.05 compared with CCAT1-siRNA group.

圖3 Western blotting 法檢測Ishiwaka 細胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail 和Twist 蛋白表達電泳圖Fig.3 Expression levels of PCNA，E-cadherin，vimentin，snail and Twist proteins in Ishiwaka cells in virous groups determined with Western blotting method

2.6 各組Ishiwaka 細胞中Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達水平與空白對照組和陰性對照組比較，CCAT1-siRNA 組和CCAT1-siRNA +LY364947 組Ishiwaka 細胞中p-Smad2/3 和TGF-β1蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與CCAT1-siRNA 組比較，CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細胞中p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；空白對照組與陰性對照組Ishiwaka 細胞中p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4和表4。

圖4 Western blotting 法檢測Ishiwaka 細胞中Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of Smad2/3，p-Smad2/3 and TGF-β1 proteins in Ishiwaka cells in various groups determined by Western blotting method

表4 各組Ishiwaka 細胞中Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of Smad2/3,p-Smad2/3 and TGF-β1 proteins in Ishiwaka cells in various groups (n＝7，)

表4 各組Ishiwaka 細胞中Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of Smad2/3,p-Smad2/3 and TGF-β1 proteins in Ishiwaka cells in various groups (n＝7，)

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group；#P＜0.05 compared with CCAT1-siRNA group.

3 討論

LncRNA 是非編碼RNA 家族成員，長度大于200 nt，不具備蛋白質編碼功能，在染色質修飾、表觀遺傳和轉錄調控等多方面發揮重要調控作用，可促進蛋白基因表達，也可抑制基因表達［6］。近年來研究［7-8］顯示：多種LncRNA 與惡性腫瘤的發生發展關系密切，在惡性腫瘤的發生發展中發揮抑癌或促癌作用，與靶蛋白組織的復雜的調控網絡在細胞增殖、分化、凋亡和侵襲遷移中發揮重要的調控作用。LncRNA CCAT1 位于c-Myc 的一個增強子區，在多種惡性腫瘤中異常表達［9］，與多種惡性腫瘤的預后關系密切，如CCAT1 可靶向miR-219a 調節宮頸癌HeLa 細胞生長、侵襲和遷移［10］；激活CCAT1 可通過調節SPRY4 和HOXB13 在食管鱗狀細胞癌中的表達影響食管鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移［11］；LncRNA CCAT1可被c-Myc 激活促進胰腺癌細胞增殖和遷移［12］。潘洪麗等［13］對子宮內膜癌細胞中LncRNA CCAT1 表達研究發現：子宮內膜癌組織中LncRNA CCAT1 呈高水平表達，沉默子宮內膜癌細胞中LncRNA CCAT1 水平可抑制子宮內膜癌細胞的侵襲和遷移。本文作者對子宮內膜癌Ishiwaka 細胞中LncRNA CCAT1 水平研究發現：Ishiwaka 細胞中LncRNA CCAT1 mRNA 表達水平升高，沉默Ishiwaka 細胞LncRNA CCAT1 表達可抑制子宮內膜癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。但LncRNA CCAT1 在子宮內膜癌中的作用機制尚不清楚。

多種信號通路參與子宮內膜癌的發生發展過程，其中TGF-β/Smad 信號通路為子宮內膜癌細胞增殖、侵襲和遷移過程中的重要通路之一。TGF-β/Smad 信號通路在腫瘤的發生發展中發揮抑制和促進腫瘤進展的雙重作用，在惡性腫瘤的起始階段，TGF-β/Smad 信號通路可抑制惡性腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制惡性腫瘤的發展；在惡性腫瘤的晚期，TGF-β/Smad 信號通路可促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡，從而促進惡性腫瘤的進展和轉移過程［14］。TGF-β/Smad 信號通路在惡性腫瘤的發生發展中，通過調節上皮間質轉化（EMT）導致惡性腫瘤細胞免疫逃避、細胞轉移和誘導血管生成等，促進惡性腫瘤的進展［15-16］。

LncRNA CCAT1 可通過多種信號通路參與惡性腫瘤的發生發展，如LncRNA CCAT1 通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路影響胃癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移過程［17］；LncRNA CCAT1 在惡性腫瘤中的作用與CCAT1 可影響惡性腫瘤細胞EMT 有關［18］；LncRNA CCAT1 通過miR-490-3p上調TGF-β 受體1 從而促進TGF-β1 誘導的卵巢癌細胞EMT［19］。LncRNA CCAT1 可通過TGF-β 誘導細胞EMT，EMT 在細胞的侵襲遷移中發揮重要作用［20］，因此推測LncRNA CCAT1 在子宮內膜癌細胞增殖、侵襲和遷移中的作用可能與TGF-β/Smad 信號通路及EMT 有關。本研究結果顯示：沉默CCAT1 及加入TGF-β/Smad 信號抑制劑均可降低細胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達水平，細胞中E-cadherin 蛋白表達水平升高。PCNA 在細胞核中合成，檢測細胞中PCNA 蛋白水平可用于評價細胞的增殖狀態［21］。E-cadherin 為重要的維持上皮細胞表型的細胞間黏附分子，E-cadherin 表達缺失或者表達降低是EMT 的重要標志［22］。Vimentin 為間質細胞的標志物，其水平升高也是EMT 的標志物［23］。snail 和Twist 為TGF-β/Smad 信號通路的上游轉錄因子，二者水平升高可促進TGF-β/Smad 信號通路激活［24-25］。p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達水平可反映TGF-β/Smad 信號通路狀況，p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達水平升高表明TGF-β/Smad 信號通路激活；反之，p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白水平降低表明TGF-β/Smad 信號通路受到抑制。因此，本研究中沉默CCAT1 及加入TGF-β/Smad 信號抑制劑均可抑制子宮內膜癌細胞增殖、侵襲和遷移，降低細胞中PCNA、Ecadherin、vimentin、snail、Twist、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達水平，細胞中E-cadherin 蛋白表達水平升高，表明沉默CCAT1 抑制子宮內膜癌細胞增殖、侵襲和遷移的機制可能與抑制TGF-β/Smad 信號通路激活、從而抑制子宮內膜癌細胞EMT 有關。

綜上所述，沉默LncRNA CCAT1 對子宮內膜癌細胞的增殖、侵襲和遷移具有抑制作用，其機制可能與沉默LncRNA CCAT1 可抑制子宮內膜癌細胞TGF-β/Smad 信號通路活化從而抑制EMT有關。