北五味子提取物對糖尿病大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox 表達的影響

曲萌 ,于春艷 ,翁詩雅,高潤澤,王珍霞,宋宇,李旭甡,鄭鴻,尹含鈺,董志恒

（1.北華大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學醫學院病理學教研室，吉林 吉林 132013；3.吉林省長春市中心醫院老年病科，吉林 長春 130051）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是獨立于高血壓和冠心病等已知心臟疾病的糖尿病患者的一種特異性心肌結構與功能的異常，以心肌肥大、纖維化、縮舒功能障礙和心力衰竭為其主要特征，現已成為糖尿病患者致死致殘的主要原因［1-3］。研究［4-5］表明：DCM 的發病是糖脂代謝紊亂及其氧化應激和細胞因子活化等多種因素綜合作用的結果，其中氧化應激（oxidative stress，OS）在DCM 的發生發展中起著重要作用。OS 是指機體氧化系統和抗氧化系統之間失衡，機體內活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）等高活性分子生成過多，進而導致組織損傷的一種狀態［6］。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是由催化亞基和調控亞基組成的酶復合體，是體內ROS 的重要來源，降低NADPH 氧化酶活性，抑制OS 反應是防治DCM 的有效方法［7］。北五味子為木蘭科植物五味子的成熟果實，含有木脂素、多糖、皂苷和黃酮等多種成分，具有收斂固澀、益氣生津和補腎寧心等作用。近年來隨著對北五味子化學成分和藥理作用深入研究及開發利用，其降血脂、抗血小板聚集和抗氧自由基等作用逐漸成為學者們研究與開發的熱點［8-9］，而有關五味子及其提取物對DCM 影響的報道較少。本研究旨在觀察糖尿病大鼠心肌組織OS 水平，并采用不同劑量北五味子提取物（Schisandrae Chinensisextracts，SCE）進行干預，探討SCE 對糖尿病大鼠心肌OS 水平的影響及其心肌保護作用，為進一步研究北五味子的藥效和藥物作用機制提供實驗依據，也為DCM 的臨床防治提供新的靶標和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器6 周齡清潔級健康雄性Wistar 大鼠59 只，體質量（210±20）g，由吉林大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（吉）2007-0003。實驗期間，室溫控制在（19±1）℃，濕度48%，所有大鼠均單籠飼養，自由飲食水。SCE 由吉林大學藥學院提供（每克提取物中含五味子甲素0.3 mg 和五味子乙素0.4 mg），鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma 公司），肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）測試盒（上海華臣生化試劑有限公司），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽激酶（GSH）測試盒（南京建成生物工程研究所），熒光實時定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司），NADPH 氧化酶亞單位NOX2 和p47phox 及內參引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，鼠抗NOX2、p47phox、β-actin 抗體和羊抗鼠二抗及增強發光（ECL）試劑盒（美國Santa Cruz 公司），其他試劑均為國產分析純。日立7150 全自動生化分析儀（日本日立公司），ABI 實時定量PCR 擴增儀（美國應用生物系統公司），電泳儀、轉膜儀和凝膠成像儀（美國Biobad 公司）。

1.2 糖尿病大鼠模型的制備、實驗動物分組及給藥所有大鼠適應性喂養1 周，空腹血糖（FBG）均正常。隨機選取其中49 只大鼠禁食12 h 后，在空腹狀態下，按55 mg·kg－1腹腔單次注射STZ（臨用前溶于0.1 mol·L－1、pH4.2 無菌檸檬酸鹽緩沖液中，終濃度為2%），分別于注射3 和7 d 后，鼠尾靜脈取血測定FBG 及尿糖定性，連續3 次FBG≥16.7 mmol·L－1，尿糖定性≥+++，且伴有多飲、多食和多尿者確定為糖尿病模型大鼠。除去4 只因FBG 急驟升高而死亡的大鼠，剩余45 只大鼠造模成功并納入實驗。同時設立正常對照組（n＝10），僅腹腔注射等體積的無菌檸檬酸鹽緩沖液。造模成功的大鼠隨機分 4 組： 模型組（n＝12）、低劑量SCE 組（n＝11）、中劑量SCE 組（n＝11）和高劑量SCE 組（n＝11）。低、中和高劑量SCE 組分別給予100、200 和400 mg·kg－1的SCE 混懸液灌胃，正常對照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，每天1 次。每周稱體質量1 次，調整用藥劑量，持續觀察12 周。實驗期間所有大鼠未使用胰島素治療。

1.3 標本留取12 周末，各組大鼠禁食，稱體質量，按3 mL·kg－1劑量腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉。在無菌條件下腹主動脈取血，分離血清用于測定FBG 和心肌酶水平。剪取心臟，冰生理鹽水沖洗后，濾紙拭干，剪去心房和右心室游離壁，稱取左心室質量，用于計算左心室質量指數（left ventricular mass index，LVMI）（LVMI＝左心室濕質量／體質量）。取左心室心尖部組織固定于10%中性甲醛，常規脫水、浸蠟和包埋，制成4 μm厚度切片，用于HE 染色。剩余左心室組織置于－80℃冰箱保存，待測心肌組織MDA 水平，SOD 和GSH 活性，熒光實時定量PCR 法檢測各組大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox mRNA 表達水平，Western blotting 法檢測各組大鼠心肌組織中NOX2和p47phox 蛋白表達水平。

1.4 實驗室指標檢測應用全自動分析儀檢測FBG 和心肌損傷標志物（CK 和LDH）水平。采用比色法測定心肌組織中MDA 水平及SOD 和GSH活性，采用考馬斯亮藍法測定組織蛋白水平。所有測定步驟嚴格按照試劑說明書操作。

1.5 實時熒光定量PCR 法檢測大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox mRNA 表達水平Trizol 法提取心肌組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，應用實時熒光定量PCR 儀進行擴增反應，反應總體積20 μ L，反應條件：95℃預變性10 min，（95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、30 s）×40 個循環，每個樣本設 6 個復孔。NOX2： 上游引物 5'-GTGTGTGAATGCCAGAGTCG-3'，下游引物5'-TTCAAAGTAAGACCTCCGAATGG-3'p47phox：上游引物5'-TCAGAATGTTGCCTGGTTGGT-3'，下游引物5'-GCCGACCTTGAACGTAACAG-3'；β-actin：上游引物5'-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3'，下游引物5'-GGGTACATGGTGGTGCCG-3'。采用2－ΔΔCt法（ΔΔCt=試驗樣品ΔCt－基準樣品ΔCt）計算各組心肌組織中目的基因mRNA 表達水平；若2－ΔΔCt＞1，提示目的基因表達水平升高；若2－ΔΔCt＜1，提示目的基因表達水平降低。

1.6 Western blotting 法檢測大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox 蛋白表達低溫提取大鼠心肌組織蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。每孔上樣50 μg 蛋白，10% SDS-PAGE 電泳分離樣品，轉膜，封閉，分別滴加β-actin（1∶2 000）、NOX2（1∶200）和p47phox（1∶200）一抗，4℃過夜。洗膜，滴加二抗（1∶2 000），37℃孵育2 h，洗膜；與ECL 發光反應液反應，化學發光成像系統顯色并分析各條帶灰度值。目的蛋白表達水平＝目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.7 統計學分析采用SPSS 19.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠血清中FBG、CK 和LDH水平，LVMI，心肌組織中MDA 水平，SOD 和GSH 活性，心肌組織中NOX2 和p47phox mRNA及蛋白表達水平均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況、血清FBG、心肌酶水平及LVMI實驗期間，正常對照組大鼠身體狀況和精神狀態良好，未發生死亡；模型組大鼠早期多動，后期反應遲鈍，精神萎靡，動作遲緩，體瘦背弓，毛豎而無光澤，多飲、多食和多尿癥狀明顯，體質量減輕，部分大鼠出現尾和趾潰爛，皮下膿腫及白內障等癥狀。與模型組比較，低、中和高劑量SCE 組大鼠飲水量、食量和尿量均明顯減少，精神狀態、行動及毛色、體態均有所好轉，尤其是高劑量SCE 組最為明顯。除正常對照組外，其余各組大鼠均有死亡，其中模型組4 只大鼠和低劑量SCE 組2 只大鼠因FBG 過高或感染死亡；高劑量SCE 組1 只大鼠死于胸部皮下感染；低、中和高劑量SCE 組各有1 只大鼠死于灌胃窒息。

與正常對照組比較，各組糖尿病大鼠FBG 水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，低、中和高劑量SCE 組大鼠FBG 均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），且呈一定的劑量依賴性。各組糖尿病大鼠心肌損傷標志物CK 和LDH 水平及LVMI 均明顯高于正常對照組（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，各劑量SCE 組大鼠血清中CK 和LDH 水平及LVMI 均有不同程度降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中高劑量SCE 組大鼠CK 和LDH 水平及LVMI 降低最明顯。見表1。

表1 各組大鼠血清中FBG、CK、LDH 水平及LVMITab.1 Levels of FBG,CK,LDH in serum and LVMI of rats in various groups(）

表1 各組大鼠血清中FBG、CK、LDH 水平及LVMITab.1 Levels of FBG,CK,LDH in serum and LVMI of rats in various groups(）

*P＜0.05，**P＜0.01vsnormal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01vsmodel group.

2.2 各組大鼠心肌組織病理形態表現HE 染色結果顯示：正常對照組大鼠心肌細胞排列整齊，細胞核明顯，大小較均勻。模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞核周圍可見空泡性病變，核固縮增多，細胞壞死，纖維化，局部可見炎細胞浸潤。與模型組比較，低、中和高劑量SCE 組大鼠心肌組織中上述病理變化均有不同程度的改善，見圖1。

2.3 各組大鼠心肌組織中OS 相關因子水平與正常對照組比較，12 周末模型組和低、中及高劑量SCE 組大鼠心肌組織中MDA水平明顯升高（P＜0.05），SOD 和GSH 活性明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，低、中和高劑量SCE 組大鼠心肌組織中MDA 水平明顯降低（P＜0.05），SOD 和GSH 活性明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），其中高劑量SCE 組干預效果更明顯。見表2。

2.4 各組大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox mRNA 表達水平12 周末，模型組和低、中及高劑量SCE 組大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox mRNA 表達水平較正常對照組明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，低、中和高劑量SCE 組大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.01）；高劑量SCE 組降低效果更明顯。見表3。

2.5 各組大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox 蛋白表達水平12 周末，與正常對照組比較，模型組大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，低、中和高劑量SCE 組大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中高劑量SCE 組降低效果更明顯。見表4 和圖2。

表2 各組大鼠心肌組織中MDA 水平和SOD 及GSH 活性Tab.2 Levels of MDA and activities of SOD and GSH in myocardium tissue of rats in various groups()

表2 各組大鼠心肌組織中MDA 水平和SOD 及GSH 活性Tab.2 Levels of MDA and activities of SOD and GSH in myocardium tissue of rats in various groups()

*P＜0.05，**P＜0.01vsnormal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01vsmodel group.

表3 各組大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox mRNA 表達水平Tab.3 Expression levels of NOX2 and p47phox mRNA in myocardium tissue of rats in various groups()

表3 各組大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox mRNA 表達水平Tab.3 Expression levels of NOX2 and p47phox mRNA in myocardium tissue of rats in various groups()

*P＜0.01vsnormal control group；△P＜0.01vsmodel group.

表4 各組大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of NOX2 and p47phox proteins in myocardium tissue of rats in various groups()

表4 各組大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of NOX2 and p47phox proteins in myocardium tissue of rats in various groups()

*P＜0.01vsnormal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01vsmodel group.

3 討論

圖2 各組大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of expressions of NOX2 and p47phox proteins in myocardium tissue of rats in various groups

DCM 是糖尿病常見慢性并發癥之一，是一種獨立的特異性心肌損傷，主要表現為心肌細胞代謝紊亂、心肌間質纖維化并伴有心臟微血管病變，最終引起左室壁肥厚，心臟舒縮功能減退。本研究采用單次腹腔注射STZ 制備糖尿病模型，造模大鼠FBG 水平明顯升高，出現多飲、多食和多尿及體質量減輕癥狀，表明糖尿病模型建立成功。本研究結果顯示：模型組大鼠LVMI 增加，血清中心肌酶CK 和LDH 水平明顯升高，心肌細胞胞質出現空泡變，核固縮增多，間質纖維化，表明12 周末糖尿病大鼠已出現明顯的心肌損傷；而經SCE 干預后，上述表現均有不同程度改善，尤其是高劑量SCE 組，提示SCE 可降低FBG 水平，減輕糖尿病模型大鼠心肌組織的異常變化，具有良好的心肌保護作用。

DCM 發病機制復雜，越來越多的研究［10-11］證實：高血糖所誘導的OS 是糖尿病心血管慢性并發癥發病進程中的高危險因素。研究［12］表明：高血糖可導致線粒體功能紊亂，產生過量的過氧化物，繼而誘導心肌細胞代謝障礙，引起心肌肥厚和間質纖維化，因此糖尿病大鼠體內ROS 的增多是引起糖尿病心肌損傷的一個重要促發因素。NADPH 氧化酶是體內組織細胞ROS 的主要來源，主要由位于細胞膜的p22phox 和gp91phox、胞質的p47phox及p67phox 構成［13-14］。NOX 是催化亞基gp91phox的同源物，廣泛存在于多種非吞噬細胞，主要包括NOX 1～5、Duox1 和Duox2，是線粒體外ROS 的主要來源［15］。研究［16-17］證實：NOX 亞單位NOX2和p47phox 的活化對NADPH 氧化酶產生ROS 起著至關重要的作用。NADPH 氧化酶的激活及其組成亞基的表達上調參與了糖尿病心血管并發癥的發生［18］。研究［19］顯示：糖尿病動物模型體內氧自由基損傷組織的重要標志物MDA 水平早期明顯升高，12 周可達到最高水平。與此同時，體內還存在抗氧化損傷的防御系統，其中SOD 和GSH 是體內清除ROS 的主要抗氧化酶，SOD 可將體內氧自由基轉化成H2O2，后者在過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的作用下再轉變成H2O，進而消除氧自由基對機體組織的損傷［20］。本研究結果顯示：12 周末，糖尿病大鼠心肌組織中NOX2和p47phox mRNA 及蛋白表達水平上調，MDA 水平升高，抗氧化酶SOD 和GSH 活性明顯下降，表明在長期高血糖環境下，糖尿病大鼠心肌組織氧化作用增強，抗氧化作用降低，氧化和抗氧化系統失衡，導致ROS 大量蓄積，OS 水平增強，進而造成脂類等生物大分子氧化損傷，導致脂質過氧化終產物MDA 水平升高，提示糖尿病高血糖狀態下心肌損傷的發生與心肌組織OS 水平增強有關，NOX2和p47phox 的活化在DCM 的發生發展中起重要的作用。

北五味子主產于我國東北地區，是長白山特產的常用中藥材，具有改善血液循環、增強免疫力、抗衰老和抗氧化等作用［21-23］。本研究結果顯示：SCE 干預12 周，可以明顯降低糖尿病大鼠心肌組織中NOX2 和p47phox mRNA 及蛋白表達水平，增加SOD 和GSH 活性，降低MDA 水平，且存在一定的劑量依賴性，表明SCE 是通過調控心肌組織OS 水平而在DCM 發展進程中發揮作用。

綜上所述，SCE 可能通過降低FBG、抑制糖尿病模型大鼠心肌組織中NADPH 氧化酶表達，增加抗氧化酶活性，降低心肌OS 水平，進而對糖尿病大鼠心肌起到保護作用，但其具體有效成分的作用以及對細胞外信號通路的影響尚有待進一步研究。