血栓彈力圖在膿毒癥凝血功能檢測中優勢的分析

陳奇

摘要：近年來，隨著對膿毒癥（Spesis）的研究不斷深入，其定義一直在不斷的修訂和更新，早期對于膿毒癥的理解是各種化膿性或致病微生物存在于血液中，但隨著臨床認知的不斷加深，隨后提出了以全身炎癥反應（Systemic inflammatory response syndrome SIRS）作為膿毒癥的核心診斷標準，而在2016年最新修訂的Spesis3.0則不再以SIRS為膿毒癥的核心診斷標準，而是以器官功能障礙作為膿毒癥的核心診斷標準（1）。對于膿毒癥定義的不斷質疑與討論體現了膿毒癥復雜的病理生理本質，隨著基礎研究的不斷深入，我們也逐漸意識到膿毒癥本質是一種由感染引起的宿主免疫功能紊亂，繼發凝血功能紊亂，并產生炎癥-凝血網絡機制不斷促進病情發展，最終導致病患發生休克，臟器功能衰竭，嚴重者可導致患者死亡。膿毒癥相關流行病學研究顯示，膿毒癥已經是全世界患者住院以及死亡的主要原因之一，其病死率達到25%并逐年提升（2），國內相關流行病學研究則顯示在2015年NMSS數據庫中報道的1937299 例死亡患者中，膿毒癥相關死亡占12.6%，根據人口普查數據計算的標化死亡率為66.7（ 95% CI 66.4～67.0） 例/10萬（3）。

【中圖分類號】R714 ??【文獻標識碼】A ??【文章編號】1673-9026（2020）06-003-04

臨床研究發現，膿毒癥患者幾乎都存在凝血功能紊亂，甚至彌漫性血管內凝血（disseminated intravascular coagulation DIC）[4] ，因此，膿毒癥對于機體正常凝血功能的損害一直受到臨床高度關注，通過研究證實，凝血功能紊亂能在膿毒癥的病理進程中起到重要作用，這種作用表現在膿毒癥相關炎癥機制對病患凝血功能的激活和級聯反應的影響，同時凝血功能紊亂也可以對膿毒癥相關炎癥機制產生影響[5]，這是一個基于宿主對感染進行反應的復雜病理過程，有基于此，臨床對于膿毒癥的治療方案也逐漸由單純抗炎，抗細胞因子治療轉變為綜合的免疫調理治療[6]來保證病患的免疫功能平衡以及凝血功能平衡，因而對于膿毒癥患者進行早期的，準確的凝血功能檢測也就顯得尤為重要[1]。

相關研究顯示，常規凝血項目對于膿毒癥凝血功能檢測并不理想，尤其是在早期診斷靈敏度不足，并且無法全面展示病患的實際出凝血狀態，相比之下，血栓彈力圖在各項試驗組數據中均表現相對優異，尤其在膿毒癥早期檢測中可以更好的提示病患可能存在的凝血功能紊亂。[7-10]，這也進一步體現了血栓彈力圖對于膿毒癥病患凝血功能檢測的臨床應用價值。

本文將結合膿毒癥相關基礎研究以及凝血功能檢測相關技術實現手段對比來分析血栓彈力圖為何在膿毒癥凝血功能的檢測中具有優勢。

膿毒癥炎癥反應

膿毒癥宿主反應主要表現為初始炎癥反應，以及之后的代償性抗炎反應綜合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome CARS），炎癥反應可以有效行使抗感染的作用，但同時會對組織造成損傷，而抗炎癥反應則可以減弱炎癥反應對組織的損傷，卻加大了二次感染的概率[11]。

膿毒癥初始炎癥反應主要表現為早期炎癥細胞因子的釋放以及固有免疫細胞對炎癥的加強[12]。膿毒癥初期炎癥反應釋放的細胞因子可以引起細胞因子風暴，早期炎癥細胞因子主要包括TNF-α，IL-1，IL-6等，其中TNF-α是炎癥最初啟動者，其由激活的單核/巨噬細胞，肝Kuffer細胞，淋巴細胞等所釋放，可以促進IL-1，IL-6，IL-8等炎癥因子的釋放。TNF-α與IL-1的協同作用可以促進炎癥的進展。這些細胞因子進一步介導大量炎癥介質的釋放，如花生四烯酸代謝產物血栓素-2（TXA 2），前列腺環素，前列腺素E2等，而這些炎癥介質促進了微循環障礙，介導了發熱，心動過速，呼吸急促，心室灌注異常等癥狀。炎癥因子的釋放會激活內皮細胞，促進白細胞的黏附和遷移，加速了組織損傷[13]。炎癥反應持續上調之后，機體會啟動代償性抗炎反應以對抗過度作用的炎癥反應，但是由于膿毒癥患者免疫功能穩態已經遭到了破壞，所以此時患者往往表現出免疫抑制狀態[14]，或稱為免疫麻痹。

在膿毒癥相關病理機制的研究中已經發現膿毒癥晚期病患往往以免疫抑制為主要表現。通過臨床試驗也表明，中和病患促炎癥因子以及增強抗炎作用的治療反而使得患者的生存率下降[15-16]。膿毒癥免疫抑制主要表現為免疫細胞的大量凋亡以及功能喪失，同時，具有抗炎作用的調節性T細胞（regulatory T cells Tregs細胞），髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells MDSCs）等大量產生，實驗顯示膿毒癥免疫抑制期患者外周血中TNF-α，IL-1β等促炎癥細胞因子不足10%，而IL-10等抗炎癥因子大量存在[17]，這也進一步證明了膿毒癥引起的早期炎癥是一種過度反應，膿毒癥晚期病患最終進展為代償性的免疫抑制狀態。 這也進一步反映了膿毒癥患者病理機制的復雜性。

膿毒癥凝血功能激活

幾乎所有的膿毒癥患者都表現凝血功能紊亂，嚴重者可能引起彌漫性血管內凝血[4]。對于膿毒癥凝血功能紊亂，最早認為是由于內皮細胞損傷而導致以激活FXII為起始的內源性凝血途徑所介導，而在Tent Cate H的實驗中發現，阻斷內源性凝血途徑并不能有效阻斷膿毒癥凝血功能的激活，在Taylor FB等的實驗中則顯示，通過阻斷TF（tissue factor）或者抑制FVII來阻斷外源性凝血途徑則可以有效阻斷膿毒癥患者的凝血功能激活，故現在一般認為膿毒癥凝血功能激活主要以TF介導的外源性凝血途徑為主[18]。

TF一般表達于大部分不直接接觸血液的組織細胞上，如血管外膜成纖維細胞，平滑肌細胞等。研究也發現粒細胞，血小板，單核細胞等均表達TF，并且通過檢測可以發現血漿內存在由內皮細胞，單核細胞，血小板等分泌的富含TF的顆粒。

TF是一個由263 個氨基酸殘基組成的跨膜單鏈糖蛋白，當血管完整性被破壞時，其從血管外膜進入血液可以啟動外源性凝血途徑，并且TF介導的外源性凝血途徑的激活速度快于內源性凝血途徑對凝血級聯的激活。在膿毒血癥中，TF一般由被激活的單核/吞噬細胞，內皮細胞，血小板等合成并分泌。

各種因素引起的血小板被大量激活加劇了膿毒癥的凝血功能紊亂以及微循環障礙。血小板在體內成栓反應中起到了重要作用，主要表現為血小板為凝血因子介導的凝血酶途徑提供了穩定的反應表面以及磷脂成分（血小板磷脂3），通過血小板對于凝血因子的吸附作用則可以在局部提高凝血因子的濃度，進一步促進了凝血級聯，同時凝血酶以及纖維蛋白的生成又可以進一步促進血小板的激活和聚集。

研究表明，膿毒癥患者的抗凝血系統以及纖溶系統受到了抑制，主要表現為抗凝血物質如AT被大量消耗，PC以及TM等則出現了抗凝功能喪失，并且因為膿毒癥導致的肝功能受損使得抗凝血物質合成不足，同時血管內皮損傷導致其通透性增加則加重了抗凝物質的流失，最終體內抗凝系統功能喪失[18]。

膿毒癥凝血與炎癥網絡機制

研究顯示，膿毒癥病理機制中存在凝血與炎癥的相互促進作用，即炎癥可以啟動并促進凝血功能異常，而凝血功能的異常則進一步了促進了炎癥的病理進程[19]。

膿毒癥細胞因子大量釋放后作用于內皮細胞首先導致內皮細胞表達抗凝機制受損，并使內皮細胞表面表達血管性血友病因子（von Willebrand Factor ?vWF），暴露內皮下膠原[20]。細胞因子進一步促進了花生四烯酸代謝產物，緩激肽等物質的釋放，并激活補體系統，以此加速了血小板的激活與聚集。而激活的血小板則可以分泌促炎癥蛋白以及生長因子[19]，并通過P一 選擇素依賴途徑與單核細胞源性吞噬細胞系統相互作用，并通過這個方式增強吞噬細胞系統組織因子的表達[21-22]。

膿毒癥時，TF可被多種細胞因子所激活，如TNF-α，IL-1，C反應蛋白（C-reactive protein CRP）等，這些細胞因子作用于單核/巨噬細胞，內皮細胞可以激活這些細胞并使之合成并分泌TF[23]，TF起始外源性凝血途徑并極大促進凝血功能紊亂的進程。隨之由凝血途徑大量激活的凝血酶則可以進一步促進血小板的激活。同時研究表明，TF本身也是一種促炎性細胞因子受體，其介導了炎癥因子的信號轉導。

研究表明，凝血酶以及一些其他活化的凝血因子可以通過裂解蛋白酶激活受體表現出一系列的促炎作用[25]。凝血酶所介導的促炎作用主要表現在①作用于內皮細胞，介導白細胞對血管壁的黏附，并激活內皮細胞使血管通透性增加，并增加PAF、IL-8、生長因子及基質金屬蛋白酶等可溶性介質的釋放;②刺激單核細胞、成纖維細胞和上皮細胞 表達IL-6、IL-8等促炎癥介質;③誘導內皮細胞表達黏附分子，并通過黏附分子“錨定”中性粒細胞，使中性粒細胞對血小板活化因子（platelet activated factor，PAF）的激活更敏感，釋放蛋白酶和活性氧更多，并加重對內皮細胞的水解和氧化損傷;④刺激中性粒細胞表達CD116/CD18，促進白細胞與內皮細胞的相互作用，促進血小板釋放CD40配體，以此促進炎癥反應[23]。

活化FX是一種絲氨酸蛋白酶，其可以通過蛋白酶激活受體（protease—activated receptor PAR）PAR-2以及PAR-3激活細胞。在內皮細胞表面的活化FX，則通過促進IL-6，IL-8，以及單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的釋放，可以引起更加強烈的炎癥反應[23]。

研究進一步顯示，抗凝血酶可以降低白細胞表達β2-選擇素，也可以通過黏附于白細胞，降低趨化因子對白細胞移行的作用，以此參與抗炎機制，同樣，蛋白C以及血栓調節蛋白（Thrombomodulin TM）等抗凝因子也在抗炎機制中發揮了重要作用[19]。

血栓彈力圖與常規凝血技術對比

膿毒癥患者體內存在著炎癥凝血網絡機制，并且這種網絡機制會隨著膿毒癥變化的病程而發生相應改變，因此，及時準確地了解病患當下的凝血功能狀況可以輔助臨床針對病患當前的凝血功能采取合理的治療措施，同時也可以輔助評估當前患者的膿毒癥整體病情，協助指導針對免疫功能的調理性治療，以此增加患者的生存率。

而針對膿毒癥的凝血功能檢測效果已經有多篇相關臨床研究的報道，結論均顯示血栓彈力圖相對于常規凝血功能檢測項目具有優勢。[7-10]。

常規凝血功能項目主要包括活化凝血活酶時間（PT），活化部分凝血活酶時間（APTT），凝血酶時間（TT），其檢測標本均為枸櫞酸鈉抗凝血漿，不包括血細胞成分。

PT主要檢測外源性凝血途徑，其原理主要是通過添加血漿凝血活酶試劑（主要成分為TF的替代物）到樣本中，以此激活外源性凝血途徑，由血漿中的FVII與試劑中的TF替代物形成TF-FVIIa復合物，最終激活凝血酶（活化FII），并由由凝血酶最終激活樣本中的纖維蛋白原，纖維蛋白最終使反應體系凝固，通過測量其凝固時間來得到PT結果，其單位為Secend，而國際標準化比值（INR）則是通過PT檢測值與PT正常對照值（正常值存在區域和人群的特點）之比的國際敏感度指數（ISI 由廠家出廠時標定）的次方來求得，INR在臨床用藥檢測，手術出血評估等方面應用十分廣泛，其做值與PT檢測的相關性很大。

APTT主要檢測內源性凝血途徑，原理是通過添加鞣花酸或白陶土等帶有負離子的異物進入樣本后可以激活以FXII起始的內源性凝血途徑，此時血漿中因為缺乏血小板，無法形成內源性凝血復合物FIXa-FVIIIa-Ca2+-PF3 ，其中PF3即血小板磷脂3，此時血小板磷脂一般由試劑中的兔腦成分代替（兔腦磷脂），反應最終激活凝血酶，由凝血酶激活纖維蛋白原，纖維蛋白使反應體系凝固，通過計算反應體系凝固時間來得到APTT的結果，單位為Secend。

TT反應原理為向反應體系中加入足量凝血酶直接激活纖維蛋白原，檢測反應體系凝固時間，該方法沒有內源性和外源性凝血激活途徑的參與，單位為Secend。

通過以上對常規凝血功能檢測的介紹可以得到的結論是，常規凝血功能檢測是無法完整體現病患體內實際凝血功能的整體狀態，尤其是在膿毒癥患者的凝血功能檢測中。

主要原因在于：（1）血小板功能在體內得以實現的基礎在于其功能的完整性和數量的保證，常規凝血功能檢測提供的血小板磷脂替代物無法和實際血小板數量以及功能相匹配，尤其在膿毒癥患者的病理機制下，血小板可能出現功能與數量的異常。（2）膿毒癥TF來源比較復雜，其含量的多少與實際凝血功能紊亂程度相關，而常規凝血功能檢測反應體系中的TF試劑替代物并不能有效反應病患此時實際情況。（3）凝血功能本身具有極其復雜的關聯性，血小板可以有效促進凝血因子途徑的凝血功能激活，而凝血功能激活途徑產物如凝血酶，纖維蛋白等又可以有效促進血小板的激活與聚集作用，所以凝血功能在體內的實現是一個十分復雜的系統，凝血功能檢測應該體現其中相關性，以此保證凝血功能的體外診斷是符合病患當前體內情況的。（4）膿毒癥患者的凝血功能與炎癥形成了復雜的交叉網絡機制。炎癥機制通過細胞因子，免疫細胞功能等方面深刻影響了凝血功能，反之，凝血功能的激活又進一步影響了炎癥的病理進程，因此，凝血功能檢測應該能夠包含反應體系中的各種影響因素，如炎癥因子對凝血因子的影響，凝血因子之間的影響，血小板與凝血因子以及炎癥因子之間的影響等。

血栓彈力圖（Thromboela-stogram TEG）是Hartert于1948年發明，上個世紀80年代開始應用于臨床，經過幾十年的發展，其使用領域已經遍及輸血，麻醉，重癥，心外，婦產等諸多臨床科室。

血栓彈力圖本質是一種粘彈性實驗，通過檢測反應體系中不斷形成的血凝塊的粘彈性變化來獲得檢測結果的血栓彈力圖。實驗裝置是由一個圓柱形塑料杯以及其杯蓋為基礎，病患全血樣本與試劑加入塑料杯中，塑料杯上方有一根敏感探針連接到插入反應體系的杯蓋中，塑料杯以4°45′的角度作逆時針和順時針緩慢的交替旋轉，塑料杯中反應體系的凝血功能被激活后，以包括血小板，凝血因子以及各種其他影響因素在內的全血體系使得塑料杯與杯蓋之間的阻力隨著凝固的加劇而不斷加大，期間不斷通過上方探針對阻力轉化為的扭轉力進行探測，記錄下來的電信號在計算機算法處理下最終得到臨床應用的血栓彈力圖。血栓彈力圖基本參數包括R時間，K時間，α角度，MA值，Ly30，Ly60等。

R時間主要表達反應體系被試劑激活后到血凝塊開始形成的時間。K時間和α角度一般聯合看待，二者綜合體現了血凝塊形成的速度。MA則體現了血凝塊形成后的最大強度，其主要影響因素是血小板數量以及功能。當血凝塊最終形成以后，反應體系內纖溶系統開始發揮主要作用，通過檢測達到MA值之后的30分鐘和60分鐘的血凝塊強度，即為Ly30和Ly60，二者共同體現了反應體系中纖溶系統功能的情況。

通過上述介紹可以得到結論：血栓彈力圖的反應體系中包含了凝血功能除血管體系以外的幾乎所有相關的關鍵要素如血小板，凝血因子，抗凝血因子，纖溶因子等等，以及影響要素如相關細胞因子，免疫細胞等。就膿毒癥來說，血栓彈力圖可以完整的體現病患當前體內實際的凝血功能狀況，這種實際狀況的體現主要表現在反應體系內細胞的實際數量情況，實際功能情況，凝血因子，抗凝血因子等實際數量與功能的情況，整個反應體系是符合體內的真實情況的反應體系。

討論

血栓彈力圖雖然通過凝血性凝血途徑激活，但是在凝血級聯放大作用機制下，血小板（比如可以被凝血酶激活）以及外源性凝血途徑（比如細胞相關TF因子的釋放和激活）會很快被激活，并參與到整個血栓彈力圖的反應體系中，因此，血栓彈力圖是一種針對凝血全貌的分析。

同時就膿毒癥來說，其病情復雜多變，早期免疫亢進以促炎癥為病理主體，而很快被代償性激活的抗炎反應又會在晚期引起代償性抗炎反應綜合征，而其中細胞因子以及相關免疫細胞的病理性變化無疑會深刻影響到當前以及未來病患凝血功能的變化，而凝血功能的變化由可以進一步影響膿毒癥病患的炎癥機制，以此為基礎的炎癥凝血交叉網絡一方面促進膿毒癥病情，另一方又被膿毒癥病情所影響，因此，能夠全面涵蓋凝血功能全貌——細胞層面，凝血因子層面，抗凝血因子層面，纖溶因子層面等，同時又可以針對患者當前體內實際各要素（包括凝血要素，炎癥要素）間相互關系的檢測才能更加有效和準確的反應病患的病情，并可以以此為依據，指導臨床的診斷以及治療工作，而血栓彈力圖的優勢無論從理論基礎和實際臨床數據中都可以看出來。

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