加減烏梅丸顆粒對哮喘大鼠激素干預模型氣道重塑及轉化生長因子-β1/Smad信號通路的影響

陳秋儀 任培中 王佳美 弓雪峰 李芷悅 崔紅生

摘要 目的：觀察加減烏梅丸顆粒對哮喘大鼠激素干預模型氣道重塑及轉化生長因子（TGF）-β₁/Smad信號通路的影響。方法：選取30只雄性SD大鼠并隨機分為正常組、哮喘組、地塞米松組、布地奈德組及中藥組，除正常組外其余組以卵蛋白致敏、霧化激發方法建立哮喘大鼠模型，除正常組和哮喘組外其余均予地塞米松干預并逐步撤減，布地奈德組予以普米克令舒霧化，中藥組予以加減烏梅丸顆粒灌胃。光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理形態學改變，測定氣道壁面積百分比（Wat%）、氣道平滑肌面積百分比（Wam%），免疫組織化學法比較各組Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）表達水平，蛋白質印跡法和熒光定量PCR法比較TGF-β₁、Smad2、Smad3、Smad7蛋白及基因表達水平。結果：與正常組比較，哮喘組大鼠氣道壁及平滑肌層明顯增厚，管腔變窄，Wat%、Wam%升高，差異有統計學意義（P<0.05），Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β₁、Smad2、Smad3蛋白及基因表達水平均升高，差異有統計學意義（P<0.05），Smad7表達水平降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與哮喘組比較，地塞米松組Wat%降低，差異有統計學意義（P<0.05），Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達水平降低，差異有統計學意義（P<0.05），TGF-β1、Smad3蛋白及基因表達水平均降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與地塞米松組比較，中藥組Wat%降低，差異有統計學意義（P<0.05），Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達水平降低，差異有統計學意義（P<0.05），TGF-β₁、Smad2、Smad3蛋白及基因表達水平均降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：加減烏梅丸顆粒可通過調控TGF-β1/Smad信號通路從而減少氣道平滑肌增生以及Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白沉積，抑制氣道壁增厚，延緩氣道重塑的發展。

關鍵詞? 加減烏梅丸顆粒;哮喘大鼠;激素干預;氣道重塑;轉化生長因子-β₁/Smad信號通路

Effect of ModifiedModified Wumei Pill Granule on Airway Remodeling and TGF-β1/Smad Signal Pathway in Asthma Rat Model with Glucocorticoids Intervention

CHEN Qiuyi，REN Peizhong，WANG Jiamei，GONG Xuefeng，LI Zhiyue，CUI Hongsheng

（Department of Respiratory Medicine，Third Affiliated Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To observe the effect of Modified Wumei Pill Granule on airway remodeling and TGF-β1/Smad signal pathway in asthma rat model with glucocorticoids intervention.Methods：Totally 30 SD mal rats were randomly divided into the normal group，the asthma group，the dexamethasone group，the budesonide group and the Chinese medicine group.Except for rats in normal group，rat in the other groups were sensitization and stimulation with ovalbumin（OVA）to establish the asthma model.Except for rats in normal and asthma groups，rats in the other groups were treated with dexamethasone and gradually withdrawn.Rats in the budesonide group were inhaled with budesonide.Rats in the Chinese medicine group were poured Modified Wumei Ppill Granule into stomach.Observe the lung histopathological changes under light microscope.Measured the percentage of total wall area（Wat%）and airway smooth muscle area（Wam%）.The expression levels of Collagen I and Collagen III in each group were compared by immunohistochemical method.The expression levels of TGF-β1，Smad2，Smad3，Smad7 protein and gene were compared by Western Blotting and RT-PCR.Results：1）Compared with the normal group，the airway wall and smooth muscle layer of asthmatic rats were significantly thicker，the lumen became narrower，Wat% and Wam% increased（P<0.05），and the expression levels of Collagen I，Collagen III，TGF-β₁，Smad2，Smad3 protein and gene increased（P<0.05），while the expression level of Smad7 decreased（P<0.05）.2）Compared with asthma group，Wat% decreased in dexamethasone group（P<0.05），Collagen I and Collagen III decreased（P<0.05），and TGF-β1，Smad3 protein and gene expression decreased（P<0.05）.3）Compared with dexamethasone group，Wat% decreased（P<0.05），Collagen I and Collagen III decreased（P<0.05），and TGF-beta 1，Smad2，Smad3 protein and gene expression decreased（P<0.05）.Conclusion：By regulating TGF-β₁/Smad signal pathway，Modified Wumei pill granule can reduce the proliferation of airway smooth muscle and the deposition of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ protein，inhibit the thickening of airway wall and delay the development of airway remodeling.

Keywords Modified Wumei Pill Granule; Asthmatic rat; Glucocorticoids intervention; Airway remodeling; TGF-β₁/Smad signal pathway

中圖分類號：R289.5;R256.12 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.005

支氣管哮喘是由多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎性疾病，臨床以吸入性糖皮質激素（Inhaled Corticosteroid，ICS）為治療首選藥物[1]。然而存在部分哮喘患者對激素治療不敏感，需長期大劑量使用ICS或全身性糖皮質激素來控制癥狀，通常將此類哮喘稱為激素依賴性哮喘（Steroid-dependent Asthma，SDA）[2]。氣道重塑是SDA發生發展的重要因素，可引起氣道彈性下降，氣流受限持續甚至不可逆，加重哮喘癥狀。目前轉化生長因子（TGF）-β₁/Smad信號通路被認為是氣道重塑的重要調控途徑，TGF-β₁可引起氣道平滑肌增殖、促使氣道膠原和蛋白沉積[3]，調節該通路平衡有望成為預防或減輕哮喘氣道重塑的新靶點。本課題組近年來運用經典名方烏梅丸加減治療SDA臨床療效顯著，為進一步研究其作用機制和作用靶點，本實驗建立哮喘大鼠激素干預模型，觀察加減烏梅丸顆粒對模型大鼠肺組織病理改變以及TGF-β₁/Smad信號通路的影響，為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取SPF級健康雄性SD大鼠30只，體質量120～140 g，鼠齡4～5周，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，飼養于北京中醫藥大學基礎醫學院動物房，適應性喂養1周。

1.1.2 藥物 加減烏梅丸顆粒（藥物組成：烏梅]10 g、制附片10 g、黨參10 g、當歸10 g、桂枝6 g、白芍10 g、細辛3 g、黃芩10 g、黃柏6 g、椒目10 g、蘇子10 g;由北京康仁堂藥業有限公司提供并制備為顆粒劑，約9 g/袋）。普米克令舒（吸入用布地奈德混懸液，澳大利亞AstraZeneca Pty Ltd公司，貨號：823740）。地塞米松磷酸鈉注射液（國藥集團容生制藥有限公司，貨號：H41020059）。卵蛋白（Ovalbumin，OVA，美國Sigma公司，貨號：A6349）。

1.1.3 試劑與儀器 Anti-Smad2抗體（美國Abcam公司，貨號：ab63576）;Anti-Smad3抗體（美國Abcam公司，貨號：ab40854）;Anti-Smad7抗體（美國Proteintech公司，貨號：25840-1-AP）;Anti-TGF beta 1抗體（美國Abcam公司，貨號：ab92486）;Anti-Collagen Ⅰ抗體（美國Abcam公司，貨號：ab34710）;Anti-Collagen Ⅲ抗體（美國Abcam公司，貨號：ab6310）;即用型免疫組織化學法試劑盒（福建邁新生物技術開發有限公司，貨號：KIT-9706）;DAB顯色試劑盒（福建邁新生物技術開發有限公司，貨號：DAB031）;ECL超敏發光液（北京博奧森生物技術有限公司，貨號：pe0010）;TRIZOL（美國Invitrogen公司，貨號：15596026）;引物由上海生工生物工程有限公司合成。壓縮式霧化器（歐姆龍有限公司，NE-C900型）;自動化智能型正置研究級顯微鏡（日本Olympus公司，BX53型）;熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，CFX96型）;凝膠成像分析系統（美國ALPHA公司，FLUORCHEM 5500型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機數字表法，將大鼠分為正常組、哮喘組、地塞米松組、布地奈德組及中藥組，每組6只。根據參考文獻[4]復制哮喘大鼠氣道重塑激素干預模型，地塞米松組大鼠于實驗第l天和第8天腹腔注射卵白蛋白（OVA，100 mg）與氫氧化鋁凝膠（100 mg）混合液致敏，第15天開始以1%OVA進行霧化激發，30 min/次，隔天1次，共7周。在每次激發前30 min給予地塞米松0.5 mg/kg腹腔注射，連用2周。從第3周開始，按每周]0.1 mg/kg速度遞減地塞米松用量，至第7周地塞米松全部]撤除。

1.2.2 給藥方法 布地奈德組大鼠在地塞米松組的基礎上，從實驗第15天開始每天給予0.5 mg/mL的普米克令舒霧化吸入，30 min/次，連續7周，第63天結束。激發日則于激發前1 h吸入。中藥組大鼠在地塞米松組的基礎上，從實驗第15天開始每天給予加減烏梅丸顆粒1.88 g/kg灌胃，1次/d，連續]7周，第63天結束。激發日則于激發前2 h灌胃。哮喘組致敏與激發流程同地塞米松組，腹腔注射以生理鹽水代替地塞米松。正常組大鼠致敏、激發、腹腔注射均使用等量生理鹽水。除中藥組外，其余組大鼠均以等量生理鹽水灌胃。

1.2.3 檢測指標與方法 于末次給藥24 h后取材，每組大鼠以3.5%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉，取仰臥位固定于手術臺上，打開腹腔，腹主動脈放血法處死大鼠，開胸。摘取左肺置于多聚甲醛中固定，用于病理形態學觀察及免疫組織化學法檢測;右肺上葉、中葉分別置于凍存管內-80 ℃冰箱保存，用于蛋白質印跡法和PCR檢測。

1）病理形態學觀察：將在多聚甲醛中固定24 h后的左肺組織依次進行乙醇脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片，行Masson染色，在光鏡下觀察，選取同一層級支氣管采集圖像，比較各組病理形態學改變。應用Image-pro Plus 6.0醫學圖像分析軟件測定支氣管外緣內面積（Area enclosed by Outer Perimeter，Ao）、氣道壁面積（Total WallArea，Wat）、氣道平滑肌面積（Airway Smooth Muscle Area，Wam），計算氣道壁面積百分比（Wat%=Wat/Ao）、氣道平滑肌面積百分比（Wam%=Wam/Ao）作為氣道重塑的觀察指標。

2）免疫組織化學檢測：取未染色的切片進行脫蠟、脫水、修復，分別用需檢測蛋白的一抗和相應的二抗進行孵育，用DAB顯色、蘇木精復染后，常規脫水、中性樹脂封片并在光鏡下觀察，選取同一層級支氣管采集圖像，應用Image-pro Plus 6.0醫學圖像分析軟件測定各組大鼠肺組織內Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）的平均吸光度值（MOD）。

3）蛋白質印跡法檢測：取出凍存的肺組織，用BCA法測定目的蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），置于5%的脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1 h，加入需檢測蛋白的一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入相應的二抗，室溫搖床孵育1 h，取出PVDF膜用ECL超敏發光液曝光。采用Quantity One軟件分析圖像，以目的蛋白與β-actin的灰度比值作為目的蛋白的相對表達量。

4）RT-PCR檢測：按照試劑盒說明，以Trizol法提取大鼠肺組織總RNA，并測定RNA濃度及純度。根據濃度取1 μg總RNA，按照反轉錄試劑盒操作說明將RNA反轉錄為cDNA。取cDNA產物2 μL，分別加入2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，]10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，去離子水7.2 μL，以20 μL反應體系進行PCR擴增。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環，獲得各樣本待測基因的CT值。采用2-△△CT法計算基因相對表達量，進行統計分析（-△△CT為目標基因CT值與內參基因CT值的差值，△△CT為實驗組△CT值與對照組△CT值的差值，2-△△CT指實驗組相對于對照組的基因表達倍數）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析或非參數檢驗，組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理形態學觀察

Masson染色結果顯示，與正常組比較，哮喘組大鼠氣道管腔明顯變窄，氣道壁、平滑肌層和基底膜層厚度顯著增加;與哮喘組比較，地塞米松組、布地奈德組、中藥組氣道改變均有減輕，氣道壁、平滑肌層和基底膜層厚度降低。見圖1。

2.2 各組大鼠氣道壁及平滑肌面積占支氣管外緣內面積百分比比較

與正常組比較，哮喘組Wat%、

Wam%均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與哮喘組比較，地塞米松組、布地奈德組及中藥組Wat%均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），中藥組Wam%顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）;與地塞米松組比較，布地奈德組、中藥組Wat%顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠肺組織內CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達比較

與正常組比較，哮喘組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與哮喘組比較，地塞米松組、布地奈德組及中藥組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）;與地塞米松組比較，布地奈德組、中藥組Collagen Ⅲ蛋白表達均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），中藥組Collagen Ⅰ蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2，圖2、3。

2.4 各組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達比較

與正常組比較，哮喘組TGF-β1、Smad2、Smad3均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05），Smad7顯著降低，差異有統計學意義（]P<0.05）;與哮喘組比較，地塞米松組、布地奈德組及中藥組TGF-β1、Smad3均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），中藥組Smad2顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）、Smad7顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與地塞米松組比較，中藥組TGF-β1、Smad2、Smad3顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3，圖4。

2.5 各組大鼠肺組織內TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA相對表達量比較

與正常組比較，哮喘組TGF-β1、Smad2、Smad3均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05），Smad7顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）;與哮喘組比較，地塞米松組、布地奈德組及中藥組TGF-β₁、Smad2、Smad3均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），Smad7顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與地塞米松組比較，布地奈德組及中藥組TGF-β₁、Smad2、Smad3均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），Smad7顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

SDA屬于重癥哮喘范疇，控制水平差，嚴重影響患者生命質量，加重社會經濟負擔[5]。該病發病機制與氣道重塑、氣道炎性異質性、遺傳易感性和糖皮質激素反應性降低等多方面因素相關[6]。研究發現，相對于輕中度哮喘患者，SDA患者存在更嚴重的氣道重塑，網狀層與基底膜厚度顯著增加，盡管使用高劑量的糖皮質激素治療，依然不能控制氣道重塑的繼續發展，反而產生嚴重的激素依賴[7]。氣道重塑可使氣道彈性下降，氣流受限持續甚至不可逆，肺功能持續下降，氣道高反應性持續，對激素治療反應性差，癥狀更加嚴重，哮喘難以控制[8-9]。因此阻抑氣道重塑的發生發展是SDA防治的核心]內容。

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