補陽還五湯對舒張性心力衰竭大鼠心肌鈣轉(zhuǎn)運蛋白表達水平的影響

李潔白，沈曉旭

心力衰竭(heart failure，HF)是多種心血管疾病的嚴重和終末階段，也是全球心血管領域的重大挑戰(zhàn)之一，其中舒張性心力衰竭(DHF)病人占總數(shù)的50%以上，為心力衰竭的主要類型，而且隨著人口老齡化和人類疾病譜的演化，這個趨勢還在進一步加劇[1]。盡管目前對DHF的預防及治療有了重要進展，但治療僅涵蓋了病理生理途徑的一部分，其發(fā)病率和死亡率仍居高不下，且不能阻止DHF向慢性終末期進展的趨勢。有專家認為心力衰竭的本質(zhì)原因之一是心肌在收縮舒張時能量供應不足或心肌的能量代謝紊亂，造成心肌的結(jié)構和代謝功能受損的一種病理狀態(tài)，多是由于心臟超負荷工作引起的，因此，衰竭的心臟又被比喻為“沒有燃料的引擎”[2]。心肌能量代謝紊亂及能量的缺失已受到越來越多的關注，而Ca2+的釋放和攝取在心肌細胞能量代謝中起關鍵作用，所以對心肌細胞內(nèi)Ca2+的循環(huán)進行干預可能成為治療DHF的切入點。因此，本實驗采用腹主動脈縮窄法建立DHF大鼠模型，并運用補陽還五湯給予中藥干預，利用聚合酶鏈式反應法(PCR)技術檢測L型鈣通道(LTCC)、蘭堿尼受體(RyR2)、肌漿網(wǎng)上的鈣泵(SERCA2a)和受磷蛋白(PLB)的mRNA轉(zhuǎn)錄表達量，探索補陽還五湯對DHF的干預效應和可能的藥物作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康SD大鼠60只，體重(190±10)g，無特定病原體(SPF)級，購自北京維通利華生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。所有實驗大鼠均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院重點學科實驗室，屏障級動物房[動物房編號：SYXK(京)2015-0001]，無菌飼料專人喂養(yǎng)，恒溫恒濕，溫度22～24 ℃，相對濕度50%。

1.2 藥物 酒石酸美托洛爾片(阿斯利康制藥有限公司，批號：國藥準字H32025391)；補陽還五湯按照《醫(yī)林改錯》所載的藥味用量進行制備，處方：生黃芪120 g，當歸尾6 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g。所有中藥均購自北京同仁堂科技發(fā)展有限公司。

1.3 試劑及儀器 超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture(With ROX)、DNase 1、5x RNA Loading Buffer(CWbio.Co.Ltd，批號：Cat.NoCW0581、Cat.NoCW0744、Cat.NoCW0956、Cat.NoCW2090、Cat.NoCW0611A)；超高分辨率小動物彩色多普勒超聲實時影像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司，型號：vevo770)，渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：QL-902)，離心機(艾本德有限公司，型號：Centrifuge 5415D)，分光光度計(賽默飛世爾科技公司，型號：NANODROP 2000)，熒光定量PCR儀(杭州博日科技有限公司，型號：Line Gene 9600 Plus)，-80 ℃冰箱(賽默飛世爾科技公司，型號：900SERIES)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及造模 60只大鼠在動物房正常飼養(yǎng)3 d后，將大鼠分為假手術組和造模組，其中假手術組15只大鼠，造模組45只大鼠。造模組參照文獻[3-4]采用腹主動脈縮窄法制成DHF模型。具體步驟如下：大鼠術前12 h禁食不禁水，用水合氯醛溶液麻醉(0.33 mL/100 g)后，將大鼠仰臥固定于手術臺上，于大鼠劍突下2～3 cm，沿腹中線切開4～5 cm切口，拉開切口，用手輕輕翻出腸管等內(nèi)臟置于生理鹽水濕潤的無菌紗布上，找到大鼠的左腎動脈，剝離腹后膜，在腎動脈分支處找到腹主動脈，在腎動脈上方0.2 cm處用4號手術線將腹主動脈與平行放置的7號針頭一起結(jié)扎，結(jié)扎后抽出針頭達到狹窄目的。關閉腹腔前將青霉素適量滴入腹腔防止術后腹部感染，回納腸管。逐層縫合切口，術后消毒傷口。假手術組大鼠不結(jié)扎腹主動脈，其余操作同模型組。術后將大鼠仰臥放回單籠飼養(yǎng)并給予保溫直到蘇醒。蘇醒后，每只大鼠給予4×105U青霉素腹腔注射，連續(xù)注射3 d。在本實驗中，造模后共死亡8只大鼠，其中造模組6只，假手術組2只，剩余52只進入后續(xù)的實驗。

造模后飼養(yǎng)10周，整個實驗過程中觀察大鼠的存活率及體重、進食、皮毛變化、精神狀態(tài)、活動情況等一般情況。10周后，利用超聲心動圖檢測大鼠左室射血分數(shù)(LVEF)和二尖瓣環(huán)舒張早期運動速度/二尖瓣環(huán)舒張晚期運動速度(e′/a′)比值，將LVEF>45%及e′/a′<1.2作為DHF模型成功的標準。經(jīng)檢測造模成功的大鼠共33只，將造模成功的大鼠運用隨機區(qū)組法分為模型組(11只)、西藥組(11只)和中藥組(11只)。

1.4.2 藥物制備 中藥煎煮、過濾后濃縮，直至藥液濃度為2.5 g/mL時停止，分裝。酒石酸美托洛爾片劑碾碎溶解于去離子水中，制成懸溶液，藥液濃度為0.000 5 g/mL，將所有藥物放于4 ℃冰箱中保存待用。

1.4.3 給藥方法 臨床治療70 kg體重的病人，每日服補陽還五湯按生藥量計為142.5 g，根據(jù)成人臨床用藥劑量及大鼠換算系數(shù)折算。具體劑量為，中藥組應用補陽還五湯12.72 g/(kg·d)灌胃，西藥組應用酒石酸美托洛爾0.004 5 g/(kg·d)灌胃，假手術組、模型組給予等量的去離子水灌胃。各組均每日灌胃1次，共給藥干預8周，給藥期間各組大鼠自由進食、進水，并持續(xù)觀察大鼠的一般狀態(tài)。

1.4.4 各組大鼠心肌鈣轉(zhuǎn)運蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測 為保證各指標檢測一致性，每組選取7只大鼠進行檢測，大鼠稱體重后麻醉，開胸取心臟，分離心底部大血管、心房及右心室，留取左心室部分，置于預冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，-80 ℃冰箱中保存，以備PCR檢測。檢測步驟如下：①用超純RNA提取試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提取組織樣本中總RNA，取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA的完整性；②利用Premier 7.0軟件，依據(jù)實時定量引物設計原則設計引物(見表1)；③用第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，將RNA模板、引物、5xRT Buffer和RNase-freeWater溶解并置于冰上備用，65 ℃孵育5 min，迅速冰浴2 min，短暫離心，繼續(xù)加入其他試劑，輕輕吸打混勻，37 ℃孵育50 min，70 ℃保溫10 min，反應結(jié)束后的cDNA放置-20 ℃保存；④進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，用UltraSYBR Mixture(With ROX)進行擴增，擴增程序為：95 ℃、10 min(95 ℃、15 s，60 ℃、60 s)×45個循環(huán)，將各樣品cDNA 10倍稀釋后取2 μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增，同時在60～95 ℃進行溶解曲線分析。反應結(jié)束后進行結(jié)果分析。選取15～25個擴增循環(huán)數(shù)(Ct)的熒光值，計算3個平復孔的擴增效率，△Ct=Ct(實驗組目的基因)-Ct(對照組目的基因)，△△Ct=[Ct(實驗組目的基因)-Ct(實驗組內(nèi)參基因)]-[Ct(對照組目的基因)-Ct(對照組內(nèi)參基因)]，計算實驗組目的基因與對照組目的基因的差異表達量，2-△△Ct=實驗組目的基因/對照組目的基因。

表1 RT-PCR檢測目的基因引物

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況 大鼠手術后等待成模的10周內(nèi)，模型組死亡2只，分析其原因可能是結(jié)扎過度導致大鼠發(fā)生心力衰竭、肺水腫、肺淤血而死亡。行縮窄術后10周，造模組大鼠有反應遲鈍、毛發(fā)枯黃無光澤、進食飲水減少等癥狀，給藥4周及8周時觀察大鼠的一般狀況，除模型組外，其余各組精神、飲食逐漸好轉(zhuǎn)，毛發(fā)恢復正常。

2.2 各組大鼠心肌鈣轉(zhuǎn)運蛋白LTCC、RyR2、SERCA2a與PLB的mRNA表達情況 各組LTCC的△Ct比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術組相比，模型組、中藥組RyR2△Ct均升高(P<0.05)，而西藥組RyR2△Ct與假手術組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術組相比，模型組、中藥組、西藥組SERCA2a、PLB的△Ct均升高(P<0.05)；與模型組相比，西藥組、中藥組SERCA2a、PLB的△Ct均降低(P<0.05)；中藥組與西藥組SERCA2a、PLB的△Ct相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2。根據(jù)RT-PCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△Ct相對定量計算公式，計算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個樣品相對于對照樣品目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。詳見表3。在以上結(jié)果的基礎上分析表3，可知模型組、中藥組RyR2的蛋白基因表達量較假手術組降低。SERCA2a和 PLB的基因表達有所變化，其中模型組與假手術組相比基因表達量均下降，而中藥組、西藥組的基因表達量較模型組上升。

表2 各組大鼠LTCC、RyR2、SERCA2a與PLB的△Ct結(jié)果比較 (±s)

表3 各組鈣轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)蛋白基因相對表達量比較

3 討 論

古代的中醫(yī)學沒有舒張性心力衰竭這一病名的記載，但查閱相關資料發(fā)現(xiàn)有與此類似的一些證候和癥狀出現(xiàn)，現(xiàn)多認為DHF屬于中醫(yī)學的“心痹”“心悸”“怔忡”“喘證”等病癥范圍內(nèi)。從中醫(yī)的觀點來看，DHF的病變部位主要在心，同時肺、脾、腎等多個臟器受累，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中最早討論了引起心衰病的病因病機，《素問》曰：“勞則喘息汗出，外內(nèi)皆越，故氣耗矣”。說明大量的體力勞動會損傷人體中的氣，造成正氣虛衰無力運行血脈，即血不能順利到達全身各處，引起心衰；《圣濟總錄》中也提出心氣虛是引起心衰病的基本病機之一?！端貑枴分羞€明確提出了飲食因素，如過食咸而傷腎，過食甘而傷脾，脾腎虛弱，則氣血生化無源，氣虛血少不能濡養(yǎng)心脈終成心衰病。后世醫(yī)家在前人的基礎上，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗總結(jié)歸納，提出了一些對DHF的病因病機的新見解?，F(xiàn)代醫(yī)家多認為本病為本虛標實之證，本虛為陽氣虧虛，標實為血瘀、痰飲、水停等邪實停聚，可見虛實夾雜是心衰病的特點。

目前，對于DHF病證分型的研究較少，還沒有統(tǒng)一的DHF辨證分型標準。對DHF的證素研究發(fā)現(xiàn)其首要發(fā)病基礎為氣虛，心氣虛應為DHF的最初原因，并將跟隨DHF的整個病程[5]。中醫(yī)學理論認為“氣為血之帥，血為氣之母，氣行則血行，氣虛則血瘀”，氣虛無法推動血液在脈道中的運行，則血行緩慢，血流不暢，壅滯于經(jīng)絡臟腑之中，加上血失統(tǒng)攝等因素，終致血瘀內(nèi)停。本課題組在總結(jié)臨床經(jīng)驗并結(jié)合前期研究的基礎上，發(fā)現(xiàn)氣虛血瘀為DHF的主要證候特點，其中氣虛為本，因虛導致邪實的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)變?yōu)樘搶嵔浑s的氣虛血瘀證。正常生理狀況下心肌細胞一個完整的收縮和舒張過程伴隨著細胞內(nèi)鈣的循環(huán)流動，包括肌漿網(wǎng)中的鈣釋放、鈣攝取和鈣儲存3部分，如果其中任何環(huán)節(jié)受到損害都會使心肌細胞的鈣平衡狀態(tài)受到影響，導致心肌的收縮舒張功能異常。其中心肌舒張過程包括Ca2+被重攝取回肌漿網(wǎng)、PLB的磷酸化等需要能量的過程，因此，心肌從收縮到弛緩的轉(zhuǎn)變需要大量的能量供應。而中醫(yī)所說的“氣”與現(xiàn)代生物學的“能量”在一定程度上有相通性，能量代謝紊亂可能是氣虛的本質(zhì)之一[6]。

本課題組運用益氣活血法治療DHF，選用益氣活血法的代表方劑，即清代王清任《醫(yī)林改錯》中的補陽還五湯。全方由大量補氣藥與少量活血藥相配，氣旺則血行，活血而又不傷正，功在補氣活血、祛瘀通絡之功。而Ca2+轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)蛋白可能成為潛在的藥物作用靶點，既往研究也表明益氣活血藥對心臟舒張收縮功能的改善作用可能與調(diào)控、維持心臟心肌細胞的正常鈣轉(zhuǎn)運有關[7]。本實驗結(jié)果表明補陽還五湯可明顯提高DHF大鼠SERCA2a和PLB的mRNA轉(zhuǎn)錄，而對于LTCC和RyR2則沒有明顯作用，提示DHF大鼠的發(fā)病機制可能與LTCC無關。RyR2主要參與心肌的收縮過程，可能不是補陽還五湯發(fā)揮作用的藥物靶點。補陽還五湯主要改善DHF大鼠SERCA2a和PLB的mRNA轉(zhuǎn)錄，而這兩種鈣轉(zhuǎn)運蛋白在心肌的舒張過程中發(fā)揮重要作用，說明補陽還五湯有可能通過作用于這兩種蛋白發(fā)揮改善DHF大鼠左室舒張功能的作用。