鼻腔給予rhEPO對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及視網(wǎng)膜功能的影響

周彥慧

隨著我國(guó)人口結(jié)構(gòu)逐漸老齡化，血管性癡呆的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其致死率和致殘率給社會(huì)和家庭帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。部分血管性癡呆病人并非腦血管本身的原因，20%～30%是由于頸動(dòng)脈狹窄所致[1]。眼動(dòng)脈是頸內(nèi)動(dòng)脈的重要分支，大多數(shù)情況下直接起源于頸內(nèi)動(dòng)脈，極少數(shù)情況下可從腦膜中動(dòng)脈發(fā)出[2]。頸內(nèi)動(dòng)脈狹窄可致眼部供血不足[3]，一系列眼部缺血性表現(xiàn)會(huì)隨之出現(xiàn)。因此，積極探索其發(fā)病機(jī)制及有效的藥物治療方法，具有重要的臨床意義。近期研究表明，促紅細(xì)胞生成素(EPO)在急性腦缺血中，通過清除自由基、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)再生等多種途徑發(fā)揮腦保護(hù)作用[1-2]，但EPO對(duì)慢性腦缺血的影響報(bào)道尚少[3]。本實(shí)驗(yàn)通過鼻腔給予血管性癡呆大鼠重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)，通過Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試其學(xué)習(xí)記憶能力，采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞(retina ganglion cell，RGC)數(shù)量的變化，進(jìn)一步探討rhEPO對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能及視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 成年健康無眼疾的雄性SD大鼠24只(裂隙燈下檢查角膜透明，瞳孔等大等圓，虹膜血管清晰，晶狀體無混濁)，體重300～340 g。由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將24只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，各8只。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均以結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立血管性癡呆模型。造模后3 d開始，實(shí)驗(yàn)組采用rhEPO(沈陽三生制藥有限責(zé)任公司)干預(yù)，假手術(shù)組與對(duì)照組以同樣方式給予等量生理鹽水。8周后行Morris水迷宮測(cè)試并摘取眼球和腦組織，行HE染色。

1.3 模型制作 結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈制備慢性腦缺血模型[3]。大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。用5%的水合氯醛(6.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，約5 min后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮、消毒(碘伏及乙醇)，逐層剪開頸前部正中處的皮膚、黏膜，鈍性分離頸部肌肉，待暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)，慢慢分離頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，注意避免金屬器械過度牽拉和鉗夾。在雙側(cè)頸總動(dòng)脈分出頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈的根部，用3號(hào)手術(shù)縫線雙重結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈并切斷血管。最后，用甲硝唑注射液清洗傷口，逐層縫合。待大鼠蘇醒后，送至有通風(fēng)設(shè)備的動(dòng)物房繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 給藥方法 50 g/L水合氯醛將大鼠麻醉，用1 mL注射器將150 U(125 μL)rhEPO交替滴入大鼠的左右鼻孔。每周給藥1次，共8周。每次給藥時(shí)堵住對(duì)側(cè)鼻孔，給藥完畢后拔除軟管，保持以上姿勢(shì)30 min，以免藥物流失。去除在滴入過程中有吞咽、口內(nèi)有液體流出的大鼠[3]。

1.5 Morris水迷宮測(cè)評(píng)學(xué)習(xí)記憶功能 大鼠于實(shí)驗(yàn)前1 d進(jìn)行Morris水迷宮試游，選取24只(2 min內(nèi)登上隱匿平臺(tái))進(jìn)入分組。兩組大鼠分別在造模前及造模后8周進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。測(cè)試期間保持水迷宮內(nèi)外的參照物不變。

1.5.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 用于測(cè)量大鼠學(xué)習(xí)能力。所有大鼠連續(xù)訓(xùn)練5 d，每天訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練的時(shí)間間隔為1 h，每次均將大鼠面向池壁不同象限點(diǎn)輕柔放入水中，記錄其四肢登上隱匿平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。設(shè)定大鼠在平臺(tái)上停留時(shí)間5 s，游泳時(shí)間120 s。如果120 s內(nèi)大鼠未找到平臺(tái)，人為將其引上平臺(tái)，其逃避潛伏期計(jì)120 s。平均逃避潛伏期的數(shù)值越小表明大鼠獲取經(jīng)驗(yàn)的能力越強(qiáng)。

1.5.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 用于測(cè)量大鼠記憶能力。實(shí)驗(yàn)第6天撤出平臺(tái)，從原平臺(tái)所在象限對(duì)側(cè)的象限點(diǎn)將大鼠面向池壁輕輕地放入水中，自動(dòng)記錄大鼠在120 s內(nèi)穿越目標(biāo)區(qū)的次數(shù)。撤除平臺(tái)后，以大鼠穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)判斷記憶能力，數(shù)值越大，記憶能力越好。

1.6 標(biāo)本取材及制備 50 g/L水合氯醛(0.65 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，剪開胸腔暴露心臟。穿刺針迅速插入心尖，剪開右心耳，用200～240 mL的生理鹽水快速?zèng)_洗，然后先快后慢灌注40 g/L多聚甲醛(pH值7.4)250～400 mL，至大鼠四肢抽搐、肝臟發(fā)白、身體僵硬。在眼球12：00 方位做好標(biāo)記后，立即摘取眼球。腦干處離斷大腦，打開顱腔，取出腦組織。

1.7 病理組織學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下觀察大腦皮層、海馬CA1區(qū)及視網(wǎng)膜的病理改變。用圖像分析軟件計(jì)算大腦皮層厚度，厚度為內(nèi)外皮層對(duì)應(yīng)點(diǎn)之間連線的距離，一張片取5處，每張片取其平均值。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 與假手術(shù)組比較，對(duì)照組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)能力降低。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)，提示rhEPO可改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)能力。詳見表1。

表1 3組大鼠逃避潛伏期比較(±s) 單位：s

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 與假手術(shù)組比較，對(duì)照組穿越平臺(tái)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示血管性癡呆大鼠記憶能力減退。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組穿越平臺(tái)次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示rhEPO可改善大鼠記憶能力。詳見表2。

表2 3組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較(±s) 單位：次

2.2 病理組織學(xué)檢查結(jié)果 對(duì)照組大腦皮層及海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元數(shù)目減少，胞體萎縮，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核固縮、溶解、消失，周圍伴空泡樣變性；假手術(shù)組及實(shí)驗(yàn)組錐體細(xì)胞排列緊密，偶見胞體縮小，細(xì)胞形態(tài)與正常接近。假手術(shù)組與實(shí)驗(yàn)組大鼠視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)清楚，各層細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常。對(duì)照組大腦皮層及視網(wǎng)膜厚度變薄萎縮，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂加重，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，可見空泡、水腫樣改變。

3 討 論

國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，EPO對(duì)多種腦損傷及視網(wǎng)膜病變模型具有多層次的神經(jīng)保護(hù)作用，但多數(shù)集中于急性腦損傷及糖尿病視網(wǎng)膜病變模型中。EPO對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用機(jī)制通過抗谷氨酸興奮毒性、抗神經(jīng)元凋亡、抗氧化清除自由基、抗炎癥等起作用[4-7]。興奮性氨基酸(excitatory amino acid，EAA)主要包括谷氨酸(glutamate，Glu)和天冬氨酸(aspartate，Asp)，腦內(nèi)以Glu為主。在缺血性腦損傷中，EAA可以通過下列機(jī)制加重神經(jīng)元損傷：①腦缺血缺氧導(dǎo)致的能量代謝障礙可造成細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降，胞外K+濃度顯著升高，神經(jīng)元去極化，Glu大量釋放；②EAA主要通過Ca2+超載介導(dǎo)細(xì)胞損傷，缺氧時(shí)Ca2+向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)減少，被肌漿網(wǎng)攝取減少，均造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。胞內(nèi)Ca2+濃度升高可激活磷脂酶A2和磷脂酶C，使膜脂質(zhì)降解，并釋放大量花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、白三烯和血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)等活性物質(zhì)，使血管收縮，血腦屏障破壞，EAA還可刺激一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)產(chǎn)生過量的一氧化氮(nitric oxide，NO)，加重神經(jīng)元損傷。EAA在各種腦損傷特別是缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。神經(jīng)元以皮質(zhì)第3、5、6層細(xì)胞，海馬錐體細(xì)胞和小腦蒲肯野細(xì)胞最為敏感，在缺血缺氧時(shí)最先受累。缺血中心區(qū)及缺血半暗帶是一個(gè)動(dòng)態(tài)的病理生理過程，隨著缺血程度的加重和時(shí)間的延長(zhǎng)，中心壞死區(qū)逐漸擴(kuò)大，缺血半暗帶逐漸縮小。半暗帶內(nèi)神經(jīng)元的病理改變?cè)谝欢〞r(shí)間內(nèi)是可逆的，如何在此時(shí)間窗內(nèi)進(jìn)行有效的干預(yù)治療，進(jìn)一步減少腦組織損傷是腦梗死治療的重點(diǎn)。Siren等[8]對(duì)大鼠腦梗死組織切片進(jìn)行末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸酶標(biāo)(TUNEL)發(fā)現(xiàn)，EPO使局部缺血性半暗帶內(nèi)的陽性標(biāo)記的凋亡神經(jīng)元明顯減少，甚至消失。

眼缺血綜合征多為內(nèi)科全身病的局部表現(xiàn)，如高血壓、動(dòng)脈硬化、糖尿病等，可引起嚴(yán)重的后果，并成為老年人的多發(fā)病。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，眼部缺血綜合征是缺血性腦病及缺血性心臟病的早期跡象，眼部缺血綜合征與腦、眼部缺血性疾病的發(fā)生有顯著的相關(guān)性，所以，眼部缺血性的頸動(dòng)脈狹窄與腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)對(duì)于頸動(dòng)脈狹窄致眼缺血疾病的研究中，采用手術(shù)方法治療頸動(dòng)脈狹窄，能夠迅速緩解眼部缺血癥狀。然而國(guó)外對(duì)于眼部缺血綜合征的最新研究表明，早期診斷治療，恢復(fù)動(dòng)脈的灌注，對(duì)于眼部缺血綜合征病人視功能的保存至關(guān)重要，并且能減少這種致盲性眼病的患病風(fēng)險(xiǎn)。

鼻腔給予rhEPO治療血管性癡呆效果較好，這種新的治療途徑可以使藥物更好地通過血腦屏障，既可以降低全身給藥的影響，又能減少藥物的不良反應(yīng)。但rhEPO對(duì)血管性癡呆的保護(hù)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。