優化新生脈散方治療心力衰竭的網絡藥理學機制分析*

閆海峰 ，王賢良 ，王 帥 ，侯雅竹 ，楊志華 ，胡 珍 ，毛靜遠

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381；2.國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381）

優化新生脈散方是基于天津中醫藥大學第一附屬醫院治療慢性心力衰竭（CHF）的驗方研制而成的中藥制劑，由生黃芪、黨參、刺五加、丹參、鱉甲（醋制）、茯苓、葶藶子、麥門冬、枳殼9味中藥組成，具有益氣活血利水的功效。在“重大新藥創制”科技重大專項（編號：2010ZX09102-202）的支持下完成了優化新生脈散方臨床前研究。研究表明優化新生脈散方能改善心力衰竭患者生存質量、增加6 min步行距離及提高射血分數[1-3]，研究顯示優化新生脈散方具有抗炎、抗氧化、保護心肌損傷的作用[4]，但尚未有研究從網絡藥理層面系統闡明其機制。網絡藥理學是以中藥藥理學、生物化學、結構生物學、基因組學與生物信息學等為一體的新興領域[5]，突出了“多成分、多靶點、多通路”的特點，為深入挖掘中藥復方治療疾病的作用機制提供新思路。筆者基于網絡藥理學的研究方法，初步系統挖掘及分析優化新生脈散方治療CHF的可能作用機制，為優化新生脈散方的應用和實驗驗證提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 候選活性成分及靶點的篩選 基于中藥系統藥理數據庫和分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）[6]以“黃芪、黨參、丹參、茯苓、葶藶子、枳殼”為關鍵詞，OB≥30%及DL≥0.18作為限定條件，從中獲取符合條件的活性成分，進而得到相應的靶蛋白，通過UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）獲得靶蛋白名稱的人源靶點基因。余下中藥“鱉甲、刺五加、麥門冬”通過BATMAN-TCM數據庫取Score cutoff≥20的化合物，并提取化合物相應靶點以補充優化新生脈散方藥物靶點。

1.2 CHF候選靶點的篩選 GeneCards數據庫（http：//www.genecards.org/）是以基因、轉錄組、蛋白質組、遺傳等信息的綜合數據庫[7]，登錄GeneCards主頁面，輸入關鍵詞“Chronic Heart Failure”，得到CHF的相關基因，以相關性分值（Relevance score）大于20為篩選條件，獲得符合條件的基因作為疾病候選靶點。

1.3 網絡構建 將優化新生脈散方藥物篩選的主要活性成分靶點與CHF的候選靶點通過OmicShare網站相互映射得到兩者重合基因，即潛在靶點。通過潛在靶點獲得相應的潛在化合物及其所屬中藥名稱，并利用Cytoscape-v3.6.0軟件建立中藥-潛在化合物-潛在靶點-疾病網絡圖。

1.4 GO功能及 KEGG富集分析 GO（Gene Ontology）是描述生物體中基因功能、基因及基因產物屬性的一種基因功能分類體系，包括細胞組分（CC）、分子功能（MF）、生物過程（BP）3個部分，因不同基因在生物體內協同發揮相應的生物學功能，基于KEGG富集通路的分析更有助于了解基因的生物學功能。將89個潛在靶點導入DAVID6.8（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）基因功能分析工具[8]，Select identifier、List type分別設置為 official gene symbol、gene list，物種限定為 homo sapiens，點擊Submit List進行GO功能及KEGG富集分析。同時。對潛在基因進行Gene ID Conversion，獲得基因相對應的ENSG編碼，以人類整個基因組為背景基因，將獲取的 ENSG編碼導入 OmicShare（www.omicshare.com/tools）網站進行KEGG通路注釋數目分析。

2 結果

2.1 候選活性成分及靶點篩選結果 以OB≥30%、DL≥0.18、Score cutoff≥20為限定條件，經TCMSP、BATMAN-TCM及UniProt數據庫檢索并剔除重復值得到候選活性成分187種及靶點520個。

2.2 CHF候選靶點篩選結果 根據Relevance score＞20的原則，通過GeneCards數據庫檢索CHF相關靶點1 107個，作為CHF候選靶點。

2.3 潛在化合物及靶點篩選結果 通過OmicShare網站將優化新生脈散方候選靶點與CHF候選靶點相互映射得到潛在靶點89個及其對應的潛在化合物85種，并根據潛在靶點與化合物可知所屬中藥名稱，見表1。

2.4 網絡構建結果 中藥-潛在化合物-潛在靶點-疾病網絡共有184個節點，721條邊，見圖1。其中，藍色節點代表中藥及疾病名稱，黃色節點代表潛在化合物，共85種，見表1，紅色節點代表潛在靶點，共有89個。網絡分析中，節點自由度（邊與邊的數目）的大小表明節點在網絡中的重要程度。根據網絡拓撲分析顯示，自由度較高的潛在化合物為槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）等，潛在靶點為 SCN5A、ADRB2、NOS2等。

2.5 GO功能及KEGG富集通路結果 利用DAVID數據庫得到潛在基因GO功能富集497條（P＜0.05），其中，生物過程（BP）382條，細胞組分（CC）50條，分子功能（MF）65條，根據基因富集數目多少分別取前 20 條（P＜0.05）信息繪制成圖，見圖 2、3、4。圖中可知優化新生脈散方治療CHF的潛在靶點富集的BP主要有細胞凋亡、增殖、缺氧反應等，CC主要與細胞外間隙、胞外區、胞外體有關，MF主要涉及蛋白結合、蛋白同源二聚體活性較多。KEGG通路富集篩選得出 139條（P＜0.05），并通過 OmicShare網站獲得潛在基因相對背景基因的KEGG通路注釋數目，見圖5。針對“信號轉導”模塊進一步分析并取排前20條（P＜0.05）富集信息繪制成圖，見圖6。其中，Ratio指潛在基因與位于該pathway條目的基因總數的比值，Ratio值越大，表示富集程度越高。氣泡大小代表基因數目的多少，氣泡越大，富集到該pathway的基因數目越多；氣泡顏色表示顯著性的高低，顏色越紅顯著性越高。結果顯示潛在基因主要富集在缺氧誘導因子-1（HIF-1）、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶 B（PI3K-Akt）、腫瘤壞死因子（TNF）等信號通路。

3 討論

心力衰竭是由多種因素造成心肌收縮/舒張功能障礙，導致心臟無法提供足夠的血液滿足周圍組織代謝的需要，從而引起一組復雜的臨床綜合征。目前，心力衰竭的發病機制主要有炎癥、氧化應激、線粒體功能障礙、心肌細胞凋亡及纖維化等[9-11]，臨床中對心力衰竭的治療作用途徑多比較單一，盡管有些藥物在改善或治療心力衰竭方面取得了進展，但心力衰竭的病死率、再住院率仍呈上升趨勢[12-13]，這為具有多成分、多靶點、多途徑作用的中醫藥治療心力衰竭提供了好的前景。

本研究利用網絡藥理學方法初步探討了優化新生脈散方治療CHF的活性成分、作用靶點及相關的信號通路。通過TCMSP平臺及BATMAN-TCM、UniProt數據庫檢索發現，優化新生脈散方共有符合條件（OB≥30%、DL≥0.18、Scorecutoff≥20）的化合物187種，將其全部納入本研究中，得到候選靶點520個，其中，與CHF相關的潛在靶點有89個，根據潛在靶點篩選出潛在化合物85種。對潛在靶點進行KEGG通路注釋“信號轉導模塊”富集分析，結果顯示主要涉及HIF-1、PI3K-Akt、TNF信號通路等，參與調控CHF發展過程的不同環節。

表1 優化新生脈散方治療CHF相關信息Tab.1 Optimized New Shengmai Powder for treatment of CHF related information

通過分析優化新生脈散方治療CHF的化合物-靶點-信號通路預測優化新生脈散方發揮治療CHF藥效可能的化合物為槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）等 85種化學成分。研究表明槲皮素可抑制心肌纖維化及氧化應激反應保護心臟的作用，其機制可通過降低丙二醛（MDA）、升高超氧化物歧化酶（SOD）及抑制活性氧（ROS）介導的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的激活[14-15]；木犀草素可通過提高心力衰竭大鼠肌漿網Ca2+-ATP酶（SERCA2a）蛋白表達及激活PI3K/Akt信號通路，改善心肌細胞收縮功能障礙[16]；山奈酚具有減輕炎癥和氧化應激防止血管緊張素Ⅱ誘導的膠原積累引起心室重構的作用，其機制可能與調控核因子（NF）-κB/MAPK及AMPK/Nrf2通路有關[17]。

此項研究所預測出優化新生脈散方治療CHF中85種潛在化合物與SCN5A、ADRB2及NOS2等89個潛在靶點有著密切聯系，其中，SCN5A是電壓門控鈉離子通道的編碼基因，在調控心臟動作電位的去極化及細胞間傳導過程中起著重要作用[18]，SCN5A蛋白表達水平的下調導致心臟鈉電流的降低，進而增加心力衰竭猝死的風險[19-21]。實驗表明ADRB2蛋白表達水平的升高可促進心力衰竭大鼠心肌細胞收縮功能[22-23]，改善心力衰竭癥狀，而NOS2可產生足夠數量的一氧化氮（NO）抑制心肌細胞的功能，從而降低衰竭心臟的肌力狀態，加速心力衰竭的進展[24]。富集分析顯示潛在靶點主要集中在HIF-1、PI3K-Akt、TNF等信號通路，研究表明在缺氧狀態下，通過激活HIF-1通路維持機體氧穩態及心臟有效的收縮功能，HIF-1的缺乏可引起血管生成障礙和心肌纖維化，從而導致心力衰竭的發展[25]。PI3K-Akt信號通路的激活影響CHF大鼠相關凋亡蛋白的表達，發揮保護心肌的效應[26]。TNF分為TNFα與TNFβ兩種，其激活引起肥大細胞分泌促炎細胞因子白介素（IL）-6，TNFα及IL-6可作為心力衰竭的潛在標記物，與心力衰竭的發展有著密切聯系[27-31]。由此可見，優化新生脈散方通過多種化合物調節多個靶點及多條通路，從而起到改善CHF的作用。

綜上所述，通過網絡藥理學的方法對優化新生脈散方治療CHF進行綜合分析，預測了優化新生脈散方治療CHF的潛在靶點及信號通路，這為深入研究優化新生脈散方藥效的作用機制提供參考。