補陽還五湯治療糖尿病周圍神經病變的網絡藥理學分子機制研究*

張露丹 ，王 金，張美英 ，劉 丹

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天津市武清區中醫醫院，天津 301700）

糖尿病周圍神經病變（DPN）是糖尿病最常見的一種并發癥[1]。其臨床表現多種多樣，四肢對稱性疼痛、感覺異常、肢端麻木、針刺痛及灼熱感等為其主要的癥狀[2-3]。晚期則可能會出現如肌無力、肌萎縮、平衡受損等運動功能障礙的表現[4]。DPN亦是致使糖尿病足部潰瘍、壞疽及非創傷性下肢截肢的常見病因，并且持續性的慢性疼痛可使患者睡眠及生活質量嚴重下降。研究顯示，隨著糖尿病的進展，至少50%的患者會發展為DPN[5]，且多達50%的DPN患者沒有明顯的臨床癥狀[6]，因此對DPN的早期篩查和及時治療十分重要。

DPN的發生機制較為復雜，如氧化應激、葡萄糖代謝異常、神經營養改變等，現代醫學的治療方法包括控制血糖、改善微循環、抗氧化、營養及修復神經等對癥治療[7]。中醫認為本病的基本病機是氣陰兩虛、脈絡瘀阻，益氣活血通絡為其基本治法[8]。補陽還五湯出自清代王清任所著的《醫林改錯》，是目前針對氣陰兩虛夾瘀型DPN使用最多的方劑。近年來，補陽還五湯治療DPN的研究也有較為全面的報道，臨床研究證實該方對治療DPN有確切療效[9-11]。筆者擬運用網絡藥理學的方法，對補陽還五湯治療DPN的分子機制進行探討，為后期的深入研究提供方向。

1 方法

1.1 補陽還五湯活性成分的篩選及作用靶點的收集利用中藥系統藥理學分析平臺[12]（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），查找補陽還五湯中的黃芪、赤芍、川芎、當歸、桃仁、紅花6味藥的化學成分，TCMSP數據庫未收錄地龍的化學成分，通過化學專業數據庫（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）進行補充檢索。以OB≥30%，DL≥0.18為條件對化學成分進行篩選，得到中藥的活性成分，再利用TCMSP數據庫查找活性成分對應的靶點，通過 UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）[13]查找靶蛋白的基因名，將其轉化為相對應的基因簡稱。

1.2 DPN疾病靶點的獲取及補陽還五湯療DPN潛在作用靶點的預測 在 Drugbank（https：//www.drugbank.ca/）[14]、GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）[15]輸入疾病名稱“diabetic peripheral neuropathy”進行檢索，將篩選結果合并，保留唯一值后獲得DPN疾病靶點集。并與上述補陽還五湯的作用靶點取交集，得到補陽還五湯治療DPN的潛在靶點。

1.3 關鍵作用靶點的篩選及蛋白相互作用（PPI）網絡的構建 將補陽還五湯治療DPN的潛在作用靶點導入 STRING 數據庫（http：//stringdb.org/），“Organism”選擇“Homo sapiens”，將置信度得分設置為“highest confidence（≥0.9）”，剔除孤立于網絡之外的靶點，得到核心靶點，將此作為補陽還五湯治療DPN的關鍵作用靶點。將獲取的蛋白相互作用關系，保存為TSV格式，保留文件中node1、node2及Combine score信息，并導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建 PPI網絡。再利用“Generate style from statistics”工具對網絡樣式進行設置，其中，節點（node）的大小和漸變顏色反映Degree值的大小，邊（edge）的粗細反映蛋白之間相互作用的強弱。

1.4 “補陽還五湯-活性成分-關鍵作用靶點”網絡的構建 為了更直觀地顯示相互作用關系，將中藥、活性成分和關鍵作用靶點信息整理為Excel表上傳至Cytoscape3.7.2軟件，并構建補陽還五湯-活性成分-關鍵作用靶點網絡，使得中藥、活性成分與靶點關系達到可視化，以探究補陽還五湯治療DPN的分子作用機制，并用于評價補陽還五湯中的活性成分及治療DPN的靶點的重要性。

1.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析 使用R軟件對“1.3”得到的關鍵作用靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，設定閾值P＜0.05為篩選標準，將結果以柱狀圖與氣泡圖的形式輸出。利用R軟件將所有關鍵作用靶點映射到KEGG數據庫的通路上，下載關鍵靶點所參與的通路圖進行分析與研究。

1.6 “補陽還五湯-活性成分-靶點-KEGG通路”網絡的構建 將上述可能參與到DPN過程的前20條KEGG信號通路，與藥物、活性成分及參與調控的靶點一起整理為Excel表，上傳至Cytoscape 3.7.2軟件，構建補陽還五湯-活性成分-靶點-KEGG通路網絡，再利用“Generate style from statistics”工具對網絡樣式進行渲染，Degree值越高，相應節點越大，在網絡中重要。

2 結果

2.1 補陽還五湯成分及作用靶點的收集 通過TCMSP、化學專業數據庫，查詢補陽還五湯7味藥的化學成分，去重后得到691個成分。其中，黃芪87個、赤芍75個、川芎189個、當歸125個、桃仁66個、紅花189個、地龍35個。以OB≥30%及DL≥0.18作為潛在的活性成分篩選條件，共得到81個符合條件的化合物，其中黃芪17個、赤芍17個、川芎6個、當歸2個、桃仁19個、紅花17個、地龍15個。將結果進行OB值排序，川芎中的川芎哚（Perlolyrine）、楊梅酮（Myricanone），赤芍中的芍藥吉酮（paeoniflorgenone）、芍藥苷（paeoniflorin），紅花中的 6-羥基山奈酚（6-Hydroxykaempferol）、醌式紅花苷（qt_carthamone）、六羥黃酮（quercetagetin）、木酚素（lignan）、山柰酚（kaempferol），黃芪中的 7-O-甲基異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、刺芒柄花素（formononetin），桃仁中的赤霉素A44（Gibberelln A44）等成分的OB值較高，表明這些成分的活性較高。再利用TCMSP數據庫依次查找81個活性成分的靶點，搜索的結果經過篩選去重后共得到238個相應作用靶點。

2.2 補陽還五湯療DPN潛在作用靶點的預測 通過Drugbank、GeneCards數據庫分別獲得 DPN疾病靶點10個、4 333個，合并去重后共獲得4 334個DPN疾病相關靶點。將補陽還五湯活性成分作用靶點與DPN疾病靶點相匹配，并通過Venny 2.1.0在線工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制韋恩圖，得到補陽還五湯治療DPN的潛在靶點154個，見圖1，其中，黃芪 78個、當歸34個、赤芍45個、川芎23個、桃仁 33個、紅花77個、地龍67個。再將以上7味藥治療疾病的靶點取交集，得到7味藥的共同靶點8個：PRSS1、ADH1C、NOS2、NOS3、ADRB2、PTGS2、F2、PTGS1，提示補陽還五湯可能通過上述共同靶點起到協同治療DPN的作用。

2.3 補陽還五湯治療DPN關鍵作用靶點的PPI網絡構建 將補陽還五湯治療DPN的154個潛在作用靶點上傳至STRING數據庫，獲得滿足篩選條件的核心靶點124個，并將得到的蛋白相互作用信息輸入Cytocape軟件繪制PPI網絡，見圖2。圖中共有124個節點，329條邊，節點平均Degree為5.350，其中靶點蛋白 MAPK1、SRC、JUN、HSP90AA1、CTNNB1、VEGFA、TNF、TP53、ESR1、MAPK14、MAPK8、AGXT、APP、NR3C1、EGFR、IL6、F2的Degree值在平均Degree值的2倍以上，提示上述蛋白在PPI網絡中有重要作用。

2.4 “補陽還五湯-活性成分-關鍵作用靶點”網絡分析 利用Cytoscape軟件將7味中藥、活性成分及124個關鍵作用靶點構建補陽還五湯-活性成分-關鍵作用靶點網絡，見圖3。整個網絡共204個節點，904條邊，其中橙紅色節點有7個，藍色節點有73個，黃色節點有124個，分別代表構成補陽還五湯的藥物、活性成分及其關鍵作用靶點。并對網絡進行拓撲分析，節點的平均Degree為8.863，大于平均Degree的節點有63個，以平均Degree值的2倍進行核心節點的篩選，結果發現，滿足條件的成分有：槲皮素、甘氨酸、山柰酚、木樨草素、β-谷甾醇、豆甾醇、異鼠李素、丙氨酸、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、黃芩素、刺芒柄花素、常春藤皂苷元，故推測這12個成分是補陽還五湯治療DPN的主要活性成分。對網絡中的靶點根據Degree值進行排序，結果發現，靶點 PTGS2、ESR1、AR、NOS2、F2、PRSS1、CA2、PTGS1與成分連接次數達30次以上，對補陽還五湯治療DPN具有關鍵作用；而靶點NOS3、MAPK8、PPARG、HSP90AA1、GSK3B、MAPK14 與成分的連接次數在20次以上，在網絡中也可能起到重要作用。

2.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析結果 GO富集分析中得到包括神經遞質代謝過程、對脂多糖的反應、神經遞質水平的調節、對細菌源性分子的反應、活性氧代謝過程、氧化應激反應、細胞對藥物的反應、α-氨基酸代謝過程等生物過程（BP）3 814條；輔酶結合、維生素結合、內肽酶活力、氨基酸結合、血紅素結合、轉錄因子活性等分子功能（MF）419條；膜區、囊腔、線粒體基質、突觸后膜、胞質囊腔、分泌顆粒內腔等細胞組成（CC）293條，見圖4。

KEGG信號通路富集結果顯示，補陽還五湯治療DPN主要涉及的通路如下：AGE-RAGE信號通路、白細胞介素（IL）-17信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、松弛素信號通路、缺氧誘導因子（HIF）-1信號通路、前列腺癌、內分泌抵抗等143條通路，見圖5。說明補陽還五湯活性成分的作用靶點散布在不同的通路途徑上，通過多途徑在DPN治療中發揮作用。

2.6 “補陽還五湯-活性成分-靶點-KEGG通路網絡”及部分通路展示 將“2.5”中得到的前20條KEGG信號通路，與參與調控的靶點、藥物及活性成分信息一起導入Cytoscape 3.7.2軟件，得到“補陽還五湯-活性成分-靶點-KEGG通路”的多維網絡，見圖6。結果顯示，圖中共有178個節點，851條邊，節點平均Degree為9.562，其中槲皮素（quercetin）的Degree值為 42，靶點蛋白 PTGS2、ESR1、AR、NOS2、NOS3、MAPK14、MAPK8、HSP90AA1、GSK3B、ESR2的Degree值在平均Degree值的2倍以上。將所有關鍵作用靶點映到KEGG數據庫中的相關通路上，得到143條通路圖，經分析對比后，選擇如下通路圖進行展示，見圖7，圖中紅色代表此研究中參與通路的關鍵靶點。

3 討論

本次網絡藥理學研究發現，在藥物活性成分的篩選中，有9種活性成分廣泛分布于補陽還五湯的多味藥物中，且已被證實有多種生物學效應。例如，槲皮素存在于黃芪、紅花中，其可能通過Akt-mTOR途徑來增加高糖培養雪旺細胞的自噬，從而對DPN起到防治作用[16-17]；β-谷甾醇存在于紅花、桃仁、赤芍、當歸中，其可通過提高脂肪組織中胰島素受體和葡萄糖轉運蛋白4的活性來調控血糖[18-19]；黃芩素、黃芩苷存在于紅花、赤芍中，其中黃芩素可通過抗氧化應激反應，抑制PKC、p38MAPK及多元醇通路的激活等途徑，起到延緩DPN發生的作用[20]。

在DPN的分子水平研究上，已有研究顯示，MAPK、SRC、TNF、IL-6 等與 DPN 的發生發展有關[21-23]，但仍有部分靶點如 PTGS2、ESR1、AR、NOS2、F2 等在網絡中的關聯性較高，在目前的研究中尚未進行充分的證實，可為日后的研究提供新方向。

通過對補陽還五湯化合物-疾病靶點進行GO及KEGG分析，發現補陽還五湯治療DPN主要涉及糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、炎癥通路、癌癥通路、內分泌抵抗通路等。

本研究發現B淋巴細胞瘤/白血病-2基因（BCL2）、IL-6、JUN、MAPK1、TNF 等 19 個基因主要富集于AGE-RAGE信號通路上，而AGE-RAGE信號通路在糖尿病周圍神經病變中起重要作用。研究證實，晚期糖基化終末產物（AGEs）可在周圍神經組織中積聚，與其受體相結合，激活NADPH氧化酶，進而誘導氧化應激，通過啟動下游關鍵細胞信號通路 p38（MAPK）途徑活化 NF-κB，進一步激活白細胞介素IL-1、IL-6、TNF-α及VEGF的表達，促進炎癥反應，最終引起神經細胞凋亡[24]。由此猜測，補陽還五湯可能通過調控AGE-RAGE信號通路中的上述相關蛋白來預防DPN發生。

IL-6、IL1B、TNF、CCL2、JUN、MAPK1 等 14 個基因主要富集在TNF信號通路。有研究表明，糖尿病神經炎癥反應可由NF-κB軸活化介導，NF-κB的衍生細胞因子TNF-α可誘導環氧合酶-2（COX-2）過度表達和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活，進一步觸發氧化應激和過度炎癥反應的發生[25]。而TNF-α、IL-1、IL-6 等可參與 DPN 的發病機制[26]。

EGFR、JUN、MAPK8、MMP1、NOS1、SRC 等 14 個基因主要富集于松弛素信號通路上，該通路是由松弛素家族多肽通過與4種松弛素家族多肽受體（RXFPs）結合后激活的復雜信號轉導途徑，可發揮廣泛的生理作用[27]。包括抗纖維化、舒張血管、抑制氧化應激、抗炎、治療心力衰竭、促進傷口愈合等[28]。另外，研究提示，松弛素-2可增加糖代謝異常患者對外周胰島素的敏感性，其可能在某一程度上反映了胰島β細胞的代償能力和對葡萄糖的反應能力[29]。為進一步探索松弛素在抑制和阻斷糖尿病及其各種并發癥中起到的作用提供方向。

BCL2、EGF、EGFR、IL-6、NOS2、VEGFA 等 12 個基因主要富集于HIF-1信號通路，HIF-1α在糖尿病多種并發癥中的作用逐漸受到重視。實驗證明，糖尿病小鼠HIF-1α是外周感覺神經元中活性氧（ROS）的上游調控因子，HIF-1α信號的激活可抑制線粒體功能障礙、降低線粒體內過多ROS的產生、并可誘導VEGF的表達，從而起到保護感覺神經元的作用[30]。

綜上，DPN發病機制錯綜復雜，運用網絡藥理學對其物質基礎及分子作用機制的研究，有助于預防及治療此病。結果提示，補陽還五湯治療疾病是通過多成分、多靶點、多通路的途徑來發揮療效，其可能通過參與抑制氧化應激及炎癥反應等多種活動發揮治療DPN的作用，為補陽還五湯治療DPN的基礎和臨床研究提供了新的方向。