白花蛇舌草-半枝蓮藥對組分對結腸腺癌Lovo細胞生物學行為的影響

包薩如拉，安桂鳳，薩如拉，蘇步德格日樂

大腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤，目前已成為我國發病率上升最快的消化道惡性腫瘤［1］。據2018年全球癌癥數據調查顯示，大腸癌的發病率居第4位，死亡率居第2位［2］。結、直腸癌均屬于大腸癌，根治性手術切除是目前最有效的治療方法［3］，但患者就診時多為中、晚期，癌細胞轉移侵犯鄰近組織，導致根治率低［4］。尤其是無法手術的患者，其5年生存率＜5%［5］。因此,對于大腸癌的治療及療效的提高，除了早期干預外，還應從其發生、浸潤和轉移的分子調控機制方面尋求新的治療靶點和藥物。白花蛇舌草和半枝蓮均有抗炎、活血化瘀、抗癌和療毒斂瘡的作用，在中藥配伍中常作藥對使用［6-7］。目前白花蛇舌草-半枝蓮藥對常融入方劑中，如“重建中氣抗癌湯I號”等［8］。此外，部分基礎研究證實，白花蛇舌草-半枝蓮藥對提取物可抑制胃癌［9］、肝癌［10］和乳腺癌［11］細胞的增殖，降低遷移和侵襲能力，并誘導細胞凋亡。目前對白花蛇舌草-半枝蓮抑制大腸癌細胞作用的報道較少。本研究旨在探討白花蛇舌草-半枝蓮對人結腸腺癌Lovo細胞生物學行為的影響，為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞及試劑 人結腸腺癌Lovo細胞購自美國ATCC公司。白花蛇舌草、半枝蓮購自內蒙古民族大學醫院中藥房，白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草的干燥全草，半枝蓮為唇形科植物半枝蓮的干燥全草。RPMI 1640培養基（美國Gibeo公司）；二甲基亞砜（美國Sigma公司）；兔抗人β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體、兔抗人蘇氨酸激酶（Akt）多克隆抗體、兔抗人血管內皮生長因子受體2（VEGFR-2）多克隆抗體、兔抗人B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）多克隆抗體、兔抗人Bcl-2相關X蛋白（Bax）多克隆抗體、兔抗人Grb2相關結合蛋白1（Gab1）多克隆抗體、兔抗人基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）多克隆抗體、兔抗人磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）多克隆抗體（英國Abcam公司）；山羊抗兔過氧化物酶二抗（北京康為世紀公司）；MTT檢測試劑盒（美國Sigma公司）；Transwell小室（美國Millipore公司）；BCA試劑盒（上海威奧生物科技有限公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天公司）。

1.2儀器 WD-9413B型凝膠成像系統（北京六一生物科技有限公司）；BX53型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；SD Cell型轉移電泳槽（美國Thermo公司）；VE-180型垂直板電泳裝置（上海天能科技有限公司）；muLISKAN-MK3酶標儀（美國Bio-rad公司）；Titan G260-300型透射電鏡（日本日立電子公司）；CytoFLEX型流式細胞儀（貝克曼公司）。

1.3白花蛇舌草-半枝蓮組分制備 白花蛇舌草-半枝蓮組分制備方法參考文獻［12］，將白花蛇舌草、半枝蓮按質量1∶1比例取材后進行3次煎煮，無菌紗布濾渣，獲得水提物，后取適量浸膏用石油醚回流脫脂，再以乙酸乙酯進行多次萃取，濃縮干燥后獲得白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分，并計算得率。得率=目標物質含量/原料物質含量×100%。根據參考文獻［12］對白花蛇舌草-半枝蓮乙酸乙酯組分進行檢測：取白花蛇舌草-半枝蓮乙酸乙酯浸膏及對羥基苯乙酮、野黃芩苷、木犀草素、芹菜素樣本，加入1 mL甲醇，充分溶解后過濾、離心，并采用超高效液相色譜（UPLC）進行分析。UPLC色譜條件：柱溫40℃，流動相為乙腈（C）-0.1%甲酸（D），梯度洗脫（0～20 min，5%C和95%D；20～22 min，100%C；22～25 min，5%C和95%D）。

1.4細胞培養與分組 取復蘇后的人結腸腺癌Lovo細胞接種于96孔板內，培養于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養基中。細胞設對照組以及低、中、高劑量白花蛇舌草-半枝蓮藥對干預組，分別予以白花蛇舌草-半枝蓮藥對0、10、30、50 mg/L處理。細胞培養條件為：37 ℃，5%CO2，隔天換液1次。各組Lovo細胞均培養72 h，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.5MTT檢測細胞增殖能力 各組細胞培養24、48、72 h后每孔加入MTT溶液50 μL，孵育4 h，加入二甲基亞砜200 μL，每組6個復孔，酶標儀調定波長為490 nm進行檢測，以每組細胞光密度（OD）值反映各組細胞增殖能力，計算增值抑制率。增殖抑制率=［（1-實驗組OD值）/對照組OD值］×100%。

1.6流式細胞術檢測細胞周期 取培養48 h的細胞，以0.25%胰酶消化，1 500 r/min離心10 min，棄上清，PBS洗2次，加70%預冷乙醇溶液，振蕩，4℃固定過夜。PBS洗2次，室溫條件下加碘化丙啶（PI）30 μL/管染色20 min，上機檢測各組細胞周期的分布情況。

1.7Transwell小室檢測細胞侵襲能力 將50 mg/L的Matrige基質膠（1∶8稀釋）平鋪在孔徑8 μm的Transwell小室聚碳酸濾膜的上室內表面，干燥過夜。在各組Lovo細胞培養48 h后，取約5×104個細胞置于Transwell的上室中，滴入無血清培養液重懸細胞，然后移至Transwell小室中層。培養24 h后，經PBS沖洗，多聚甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡下計數穿膜的細胞個數，實驗獨立重復6次，以視野內平均細胞數表示細胞侵襲能力。

1.8劃痕實驗檢測細胞遷移能力 用記號筆在6孔板背面劃多條直線，取培養48 h的各組細胞，每孔鋪1×106個細胞，用1 mL槍頭垂直于板底和直線劃痕，記錄寬度拍照。加入無血清DMEM培養基繼續培養24 h，PBS沖洗3次記錄細胞劃痕寬度，實驗獨立重復6次，計算細胞劃痕閉合率。劃痕閉合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.9TUNEL法檢測細胞凋亡 取對數生長期的各組Lovo細胞，將1×106個細胞接種于6孔板中，經過0.1%Trition X-100透化后，加入3%H2O2200 μL，PBS漂洗后加入蛋白酶K滅活DNA和RNA，最后加入TUNEL工作液，恒溫箱中避光孵育60 min。取出后經PBS沖洗3次加入DAPI反應液，反應20 min后沖洗封片。應用熒光顯微鏡觀察細胞，綠色代表已凋亡細胞，藍色代表存活細胞，實驗獨立重復6次。凋亡指數＝各視野陽性細胞數/視野所有細胞總數×100%。

1.10Western blot法檢測Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白表達 取各組待測樣品12 μL，蛋白Marker 5 μL，SDS-PAGE進行電泳，轉膜，封閉，加入Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt、MMP-9、Bcl-2及Bax蛋白一抗（均為1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜，洗膜，加入二抗（1∶700稀釋），室溫孵育2 h，洗膜，ECL顯像，用凝膠圖像處理系統分析表達水平，實驗獨立重復6次。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。

1.11統計學方法 采用SPSS 19.0軟件對數據進行處理。符合正態分布的計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對組分制備結果 白花蛇舌草-半枝蓮藥對經乙酸乙酯萃取后得率為0.61%。UPLC分析結果顯示，白花蛇舌草-半枝蓮藥對中主要含有對羥基苯乙酮、野黃芩苷、木犀草素和芹菜素4種化合物，符合白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分成分。見圖1。

2.2 4組細胞增殖抑制率變化 與對照組相比，培養24、48及72 h后，低、中、高劑量組細胞的增殖抑制率增加，呈劑量依賴性，差異有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

2.3 各組Lovo細胞周期分布變化 與對照組相比，低、中、高劑量組培養48 h后，G1期腫瘤細胞比例增加，S期和G2期細胞比例減少，且呈劑量依賴性（均P＜0.05）。見圖2、表2。

Fig.1 UPLC analysis of the components of Hedyotis diffusa-Sculellaria barbata圖1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對組分UPLC分析譜

Tab.1 The proliferation inhibition rates in the four groups of Lovo cells表1 4組Lovo細胞增殖抑制率變化 （n=6，±s）

Tab.1 The proliferation inhibition rates in the four groups of Lovo cells表1 4組Lovo細胞增殖抑制率變化 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01，a與對照組比較，b與低劑量組比較，c與中劑量組比較，P＜0.05，表2～5同

增殖抑制率（%）組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F 24 h 1.26±0.15 6.05±0.33a 15.84±2.40ab 20.37±3.45abc 250.322＊＊48 h 2.45±0.31 10.33±1.32a 20.54±1.69ab 30.86±4.98abc 117.240＊＊72 h 4.32±0.57 15.05±1.34a 35.43±2.98ab 40.40±3.87abc 252.602＊＊

Fig. 2 The pictures of cell cycle distributions in the four groups of Lovo cells圖2 4組Lovo細胞細胞周期分布圖

2.4 4組Lovo細胞侵襲、遷移及凋亡水平的變化比較 與對照組相比，低、中、高劑量組培養48 h后侵襲細胞數和劃痕閉合率明顯減少，細胞凋亡指數增高，且呈劑量依賴性，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖3～5。

Tab.2 Changes of cell cycle distributions in the four groups of Lovo cells表2 4組Lovo細胞細胞周期分布變化 （n=6，%，±s）

Tab.2 Changes of cell cycle distributions in the four groups of Lovo cells表2 4組Lovo細胞細胞周期分布變化 （n=6，%，±s）

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F細胞周期G1 32.45±4.48 40.38±3.99a 50.69±3.94ab 59.37±4.10abc 50.538＊＊S 17.64±2.86 13.99±1.50a 12.04±1.34ab 10.25±1.23abc 14.128＊＊G2 49.91±3.02 45.93±2.13a 36.57±3.06ab 29.68±2.23abc 66.347＊＊

Tab.3 Changes of invasive cell number,scratch closure rate and apoptosis index in the four groups of Lovo cells表3 4組Lovo細胞侵襲細胞數、劃痕閉合率及凋亡指數變化 （n=6，±s）

Tab.3 Changes of invasive cell number,scratch closure rate and apoptosis index in the four groups of Lovo cells表3 4組Lovo細胞侵襲細胞數、劃痕閉合率及凋亡指數變化 （n=6，±s）

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F侵襲細胞數（個/視野）118.65±5.87 110.26±5.37a 69.85±6.16ab 44.67±4.95abc 431.360＊＊劃痕閉合率（%）93.47±6.41 84.49±5.12a 71.34±5.79ab 49.17±2.95abc 128.317＊＊凋亡指數（%）7.62±0.67 9.92±1.16a 16.56±2.16ab 28.17±3.95abc 139.478＊＊

2.5 各組細胞Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白表達檢測結果 與對照組相比，低、中、高劑量組細胞中Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt、MMP-9及Bcl-2表達降低，Bax表達升高，呈劑量依賴性，差異有統計學意義（均P＜0.05）。表4、5，見圖6。

Tab.4 Expressions of Gab1,VEGFR-2,PI3K and Akt proteins in the four groups of Lovo cells表44組Lovo細胞Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt蛋白表達結果 （n=6，±s）

Tab.4 Expressions of Gab1,VEGFR-2,PI3K and Akt proteins in the four groups of Lovo cells表44組Lovo細胞Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt蛋白表達結果 （n=6，±s）

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F Gab1/β-actin 1.15±0.11 0.72±0.07a 0.54±0.07ab 0.31±0.04abc 150.650＊＊VEGFR-2/β-actin 0.91±0.10 0.72±0.07a 0.64±0.05ab 0.37±0.04abc 72.460＊＊PI3K/β-actin 1.26±0.12 0.99±0.09a 0.76±0.08ab 0.54±0.04abc 95.084＊＊Akt/β-actin 0.94±0.06 0.72±0.06a 0.59±0.09ab 0.39±0.06abc 55.984＊＊

Fig.3 Changes of the invasion ability in the four groups of Lovo cells(×400)圖3 4組Lovo細胞侵襲能力變化（×400）

Fig.4 Changes of the migration levels in the four groups of Lovo cells(×400)圖4 4組Lovo細胞遷移能力變化（×400）

Fig.5 Changes of the apoptosis rate in the four groups of Lovo cells(TUNEL staining,×200)圖5 4組細胞凋亡水平變化（TUNEL染色，×200）

3 討論

王單單等［12］通過中藥系統藥理學分析平臺，預估白花蛇舌草-半枝蓮藥對中19種成分可影響大腸癌細胞33個靶點及25條信號通路，有望成為大腸癌治療的輔助藥物。本實驗采用0、10、30、50 mg/L的白花蛇舌草-半枝蓮藥對組分干預人結腸腺癌Lovo細胞，發現白花蛇舌草-半枝蓮藥對組分可增加Lovo細胞G1期比例，誘導細胞凋亡，并抑制Lovo細胞增殖、侵襲、遷移能力，且具有劑量依賴性。筆者推測白花蛇舌草-半枝蓮藥對組分可將Lovo細胞阻滯于G1期，抑制結腸腺癌Lovo細胞增殖；并通過誘導癌細胞的凋亡，降低其遷移和侵襲能力。

Tab.5 Expressions of MMP-9,Bcl-2 and Bax proteins in the four groups of Lovo cells表5 各組Lovo細胞MMP-9、Bcl-2及Bax蛋白表達 （n=6，±s）

Tab.5 Expressions of MMP-9,Bcl-2 and Bax proteins in the four groups of Lovo cells表5 各組Lovo細胞MMP-9、Bcl-2及Bax蛋白表達 （n=6，±s）

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F MMP-9/β-actin 1.17±0.09 0.94±0.06a 0.71±0.06ab 0.52±0.04abc 162.537＊＊Bcl-2/β-actin 0.96±0.067 0.74±0.06a 0.51±0.04ab 0.32±0.03abc 256.348＊＊Bax/β-actin 0.25±0.04 0.43±0.03a 0.59±0.04ab 0.71±0.04abc 261.073＊＊

Fig.6 Electrophoretic diagram of Gab1,VEGFR-2,PI3K,Akt,MMP-9,Bcl-2 and Bax in the four groups of Lovo cells圖6 4組Lovo細胞Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt、MMP-9、Bcl-2及Bax表達

Gab1是一種多底物適配蛋白，Gab1在N端附近具有高度保守的富含脯氨酸PH結構域，且含有多個SH2和SH3結合位點和Met偶聯序列［13］。PH結構域能夠結合細胞膜上的PIP3蛋白，將Gab1錨定在細胞膜內表面，進一步增加Gab1與受體相互作用的機會。SH2結合位點可以綁定包含YXXP序列的信號分子，如PI3K亞基p85、SHP2、PLC-γCrk，發揮生物效應［14］。Gab1與腫瘤特別是胃腸道腫瘤的發生、侵襲和轉移密切相關［15］。Bai等［16］證實大腸癌組織中高表達Gab1，并且Gab1與患者癌組織分化和淋巴轉移相關。VEGFR-2可以增加MMP-9的表達，降解細胞外基質（ECM）和基底膜的主要成分膠原Ⅳ，促進腫瘤細胞轉移及侵襲能力，并與腫瘤血管和淋巴系統的生成有關［17-18］。PI3K/Akt信號通路通過多種機制調控體內腫瘤的生物學行為，與大腸癌細胞侵襲和凋亡、血管及淋巴管形成、腫瘤預后等密切相關［19-21］。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax與Bcl-2同族，具有誘導腫瘤細胞凋亡作用，Bcl-2與Bax比例影響腫瘤細胞的凋亡走向［22］。Gab1可介導VEGFR-2激活PI3K/Akt信號通路，并增加PI3K/Akt通路的活化程度，促進細胞侵襲，而MMP-9是PI3K/Akt重要的下游靶蛋白［23-25］。

為了進一步探究白花蛇舌草-半枝蓮對結腸腺癌Lovo細胞生物學影響的具體機制，筆者對Lovo細胞中Gab1/VEGFR-2/PI3K/Akt信號通路蛋白及MMP-9、Bax和Bcl-2的表達進行檢測。發現白花蛇舌草-半枝蓮藥對組分低、中、高劑量組細胞中VEGFR-2、Gab1、PI3K、Akt、Bcl-2及MMP-9表達降低，Bax表達升高，呈劑量依賴性。結合Lovo細胞生物學行為實驗結果，筆者分析認為白花蛇舌草-半枝蓮藥對組分可能通過抑制Gab1/VEGFR-2/PI3K/Akt信號通路表達，抑制下游MMP-9表達，使腫瘤細胞難以降解ECM和基底膜，削弱Lovo細胞侵襲和遷移能力；同時，PI3K/Akt通路的低表達，促使Bcl-2/Bax失衡，誘導細胞凋亡，與TUNEL檢測結果一致。

綜上所述，白花蛇舌草-半枝蓮藥對組分可抑制結腸腺癌Lovo細胞增殖、遷移及侵襲能力，并誘導細胞凋亡。其機制可能與阻滯腫瘤細胞分裂周期、抑制Gab1/VEGFR-2/PI3K/Akt信號通路有關。