厄貝沙坦激活PPAR-γ介導(dǎo)AMPK/mTOR通路誘導(dǎo)自噬改善LO2細(xì)胞脂肪變

鐘娟，雷任國(guó)，鐘慶榮，覃亞勤，黎洪棉△

隨著人們生活水平的提高，近年來我國(guó)非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率呈顯著增高的趨勢(shì)，并已超過病毒性肝炎而居肝臟疾病首位，同時(shí)患病人群呈年輕化趨勢(shì)［1］。有研究顯示，NAFLD與高血壓、糖尿病密切相關(guān)，三者可協(xié)同增加心腦血管疾病的發(fā)生及死亡風(fēng)險(xiǎn)［2］。目前NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，且無確切有效的治療藥物。血管緊張素受體阻滯劑（angiotensin receptor blockers，ARB）類降壓藥厄貝沙坦除具有降壓作用之外，其作為過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR-γ）的選擇性激動(dòng)劑，還具有調(diào)控瘦素、脂聯(lián)素、前列腺素等多種激素的分泌，調(diào)節(jié)糖、脂代謝紊亂，減輕肝臟脂質(zhì)沉積、改善脂肪肝的作用［3-4］。筆者前期應(yīng)用先天瘦素受體基因缺失的db/db小鼠NAFLD模型，觀察厄貝沙坦對(duì)其肝臟脂肪變的療效及作用機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，厄貝沙坦可通過激活PPAR-γ及提高磷酸腺苷依賴的蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）磷酸化表達(dá)水平，降低哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）磷酸化的表達(dá)，從而誘導(dǎo)自噬，減輕db/db小鼠肝臟脂肪變［3，5］。本研究采用脂混合物（lipid mixture，LM）誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞模型，并加用PPAR-γ抑制劑進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步探討厄貝沙坦通過調(diào)控PPAR-γ介導(dǎo)AMPK/mTOR信號(hào)通路，改善NAFLD的作用機(jī)制，為NAFLD的防治研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 （1）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：正常人源肝細(xì)胞LO2購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)，凍存于南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院分子生物實(shí)驗(yàn)室。（2）藥物與試劑：厄貝沙坦片（150 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字J20080061，生產(chǎn)批號(hào)5A173）購(gòu)自杭州賽諾菲制藥有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；LM（貨號(hào)L0288）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PPAR-γ抑制劑（T0070907）購(gòu)自Selleck Chemicals公司；兔源一抗PPAR-γ、AMPK、磷酸化AMPK（p-AMPK）、mTOR、磷酸化mTOR（p-mTOR）、LC3B購(gòu)自美國(guó)CST公司；ECL顯影液、鼠源一抗β-actin以及HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、細(xì)胞三酰甘油（TG）和總膽固醇（TC）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)自南京建成有限公司。（3）儀器：超凈臺(tái)SW-LG-IF（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；垂直電泳儀（美國(guó)Bio-RAD公司）；倒置顯微鏡XD101型（南京江南光電股份有限公司）；microplate reader酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；紫外可見分光光度計(jì)756型（上海第三分析儀器廠）；Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)（美國(guó)Kodak公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) LO2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入1%青鏈霉素雙抗，置于5%CO2、37℃無菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液1次，待細(xì)胞融合至80%進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LO2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2厄貝沙坦母液配置 精確稱取厄貝沙坦42.85 mg，充分溶于2 mL DMSO溶劑中，得到50 mmol/L的厄貝沙坦母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)使用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋為所需濃度。

1.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 在96孔板中接種LO2細(xì)胞懸液（每孔100 μL，約5 000個(gè)細(xì)胞），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，棄去培養(yǎng)基，向各孔中加入不同濃度（0、1.25、2.5、5、10、20μmol/L）的厄貝沙坦溶液100 μL，同時(shí)設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的孔為空白對(duì)照孔。將培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，在37℃下孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄上清液。后每孔加入200 μL DMSO，在酶標(biāo)儀上選定490 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的吸光度（A）值。細(xì)胞活性率（%）=［A（加藥）-A（空白）］/［A（0 μmol/L加藥）-A（空白）］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞造模、分組和藥物干預(yù) 根據(jù)MTT檢測(cè)結(jié)果篩選厄貝沙坦最佳作用濃度10 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，采用2.5%的LM誘導(dǎo)LO2細(xì)胞，建立細(xì)胞脂肪變模型［6］。造模后細(xì)胞分為模型組、厄貝沙坦組和厄貝沙坦聯(lián)合PPAR-γ抑制劑組（聯(lián)合干預(yù)組），另設(shè)正常組。模型組細(xì)胞繼續(xù)予含2.5%的LM培養(yǎng)基培養(yǎng)；厄貝沙坦組細(xì)胞予含10 μmol/L厄貝沙坦的培養(yǎng)基進(jìn)行干預(yù)；聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞予含10 nmol/L T0070907和10 μmol/L厄貝沙坦的培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體配置方法如下：先稱取T0070907 0.5 mg充分溶于1.8 mL DMSO溶劑中，得到1 mmol/L的T0070907母液，再取2 μL T0070907母液使用10 μmol/L厄貝沙坦培養(yǎng)液稀釋至10 nmol/L；正常組細(xì)胞采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，各組細(xì)胞給藥后再培養(yǎng)24 h。

1.2.5LO2細(xì)胞TG、TC含量的檢測(cè) 培養(yǎng)LO2細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至50%左右，按1.2.4方法進(jìn)行藥物干預(yù)后，予0.25%胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液以187×g離心10 min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀。采用ELISA法檢測(cè)TG和TC含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6LO2細(xì)胞油紅O染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LO2細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后以1×106個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至50%左右，按1.2.4方法進(jìn)行藥物干預(yù)后，終止培養(yǎng)，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，予4%多聚甲醛固定30 min，之后用新鮮配制的油紅O工作液染色15 min，60%的異丙醇漂洗脫色，再用蘇木素溶液復(fù)染2～3 min，PBS漂洗后觀察。應(yīng)用異丙醇提取細(xì)胞，紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)油脂含量［7］。

1.2.7蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)LO2細(xì)胞PPAR-γ及AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 采用RIPA裂解液于4℃提取蛋白，12 000×g離心15 min，所得上清即為提取到的蛋白溶液，采用BCA蛋白定量法測(cè)各組蛋白濃度。每孔上樣量為20 μg蛋白，行SDS-PAGE分離，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PPAR-γ、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、LC3B、β-actin一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次、每次5 min，按照1∶2 000稀釋羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次、每次5 min。ECL顯影液曝光，運(yùn)用Image Station 2000R圖像工作站取像。以β-actin為對(duì)照內(nèi)參，目的蛋白/內(nèi)參蛋白的灰度值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)LO2細(xì)胞LC3B的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LO2細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至50%左右，按1.2.4方法進(jìn)行藥物干預(yù)后，終止培養(yǎng)，4%多聚甲醛孵育30 min，0.2%Triton-100室溫透化15min，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，冷PBS漂洗3次，每次5 min。細(xì)胞加入LC3B一抗（1∶50），置于4℃冰箱孵育過夜。加入熒光二抗室溫孵育1 h，經(jīng)PBS漂洗后，予DAPI染液室溫作用10 min復(fù)染細(xì)胞核。LSM710激光共聚焦顯微鏡下觀察、取圖，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0（IPP）軟件測(cè)量熒光陽性細(xì)胞的LC3B平均熒光點(diǎn)數(shù)，即總熒光點(diǎn)（dots）/細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 厄貝沙坦對(duì)LO2細(xì)胞活力的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，加入0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L厄貝沙坦的 LO2細(xì)胞活性率（%）分別為：100.00±0.00、99.40±2.49、95.65±3.24、94.68±4.36、94.80±4.26、72.21±6.30（n=3，F(xiàn)=20.605，P＜0.01）。10 μmol/L 及以下濃度的厄貝沙坦對(duì)LO2細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯毒性作用，20 μmol/L厄貝沙坦對(duì)細(xì)胞毒性作用較大，表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

2.2 厄貝沙坦對(duì)脂混合物誘導(dǎo)LO2細(xì)胞TG、TC含量的影響 模型組LO2細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量較正常組明顯升高（P＜0.05）；經(jīng)厄貝沙坦治療后，LO2細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量較模型組降低（P＜0.05）；經(jīng)厄貝沙坦聯(lián)合PPAR-γ抑制劑干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量較厄貝沙坦組明顯升高（P＜0.05），與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1 The contents of TG and TC in LO2 cells of four groups表1 各組LO2細(xì)胞TG和TC的含量（mg/g prot，±s）

Tab.1 The contents of TG and TC in LO2 cells of four groups表1 各組LO2細(xì)胞TG和TC的含量（mg/g prot，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與厄貝沙坦組比較，P＜0.05

TC 7.14±2.04 24.56±5.31a 14.83±3.43ab 22.79±4.33ac 12.250＊＊組別正常組模型組厄貝沙坦組聯(lián)合干預(yù)組F n3 3 3 3 TG 14.26±2.02 85.78±6.02a 48.52±5.21ab 79.07±5.23ac 135.546＊＊

2.3 厄貝沙坦對(duì)脂混合物誘導(dǎo)LO2細(xì)胞油紅O染色的影響 模型組油紅O染色可見大量脂質(zhì)沉積，經(jīng)異丙醇提取細(xì)胞分光光度法分析，模型組細(xì)胞內(nèi)油脂含量明顯高于正常組（P＜0.05）；經(jīng)厄貝沙坦治療后，油紅O染色顯示脂質(zhì)沉積明顯減少，細(xì)胞內(nèi)油脂含量低于模型組（P＜0.05）；經(jīng)厄貝沙坦聯(lián)合PPAR-γ抑制劑干預(yù)后，油紅O染色顯示脂質(zhì)沉積顯著加重，細(xì)胞內(nèi)油脂含量明顯高于厄貝沙坦組（P＜0.05）。見圖1、2。

Fig.1 Quantitative analysis of oil red O staining and oil red O staining in LO2 cells圖1 厄貝沙坦對(duì)脂混合物誘導(dǎo)LO2細(xì)胞油紅O染色的影響

Fig.2 Comparison of the lipid content in LO2 cells detected by cell spectrophotometry between the four groups圖2 細(xì)胞分光光度法檢測(cè)各組LO2細(xì)胞內(nèi)油脂含量的比較

2.4 厄貝沙坦對(duì)脂混合物誘導(dǎo)LO2細(xì)胞PPAR-γ介導(dǎo)AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響 與正常組比較，模型組LO2細(xì)胞PPAR-γ和p-AMPK蛋白表達(dá)水平降低，p-mTOR蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，經(jīng)厄貝沙坦治療后，LO2細(xì)胞PPAR-γ和p-AMPK蛋白表達(dá)水平升高，p-mTOR蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與厄貝沙坦組比較，經(jīng)厄貝沙坦聯(lián)合PPAR-γ抑制劑干預(yù)后，LO2細(xì)胞PPAR-γ和p-AMPK蛋白表達(dá)水平降低，p-mTOR蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。聯(lián)合干預(yù)組與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

Fig.3 Irbesartan activated the PPAR-γ-mediated AMPK/mTOR signaling pathway圖3 厄貝沙坦對(duì)PPAR-γ介導(dǎo)AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響

2.5 厄貝沙坦對(duì)脂混合物誘導(dǎo)LO2細(xì)胞LC3B表達(dá)的影響 Western blot和激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3B的表達(dá)，LC3B蛋白Western blot為雙條帶，即LC3BⅠ和LC3BⅡ。結(jié)果均顯示，模型組LO2細(xì)胞LC3B蛋白表達(dá)水平低于正常組（P＜0.05）；經(jīng)厄貝沙坦治療后，LO2細(xì)胞LC3B蛋白表達(dá)水平較模型組升高（P＜0.05）；經(jīng)厄貝沙坦聯(lián)合PPAR-γ抑制劑干預(yù)后，LO2細(xì)胞LC3B蛋白表達(dá)水平較厄貝沙坦組降低（P＜0.05），與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4～6。

3 討論

NAFLD是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷，是全球最常見的肝病，但至今尚無特效治療方法。厄貝沙坦在臨床上主要用于降壓治療，并可以通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)起到肝臟保護(hù)的作用。近來大量的實(shí)驗(yàn)及臨床研究已證實(shí)，厄貝沙坦還具有PPAR-γ激動(dòng)功能，是一種選擇性PPAR-γ激動(dòng)劑，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，調(diào)節(jié)糖、脂代謝，可用于NAFLD、代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的治療［8-9］。

PPARs是核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，其存在3種亞型：PPAR-α、PPAR-δ（也稱PPAR-β）和PPAR-γ，其中PPAR-γ是被研究最深入的亞型。PPAR-γ的生物學(xué)功能復(fù)雜多樣，包括降血脂和血壓，抑制炎癥反應(yīng)，抗纖維化等［10-11］。PPAR-γ是脂肪細(xì)胞基因表達(dá)和胰島素細(xì)胞間信號(hào)傳遞的主要調(diào)節(jié)者，參與脂肪細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存。PPAR-γ被激活后，不僅可以通過促進(jìn)脂肪形成和調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子（如瘦素、脂聯(lián)素等）的表達(dá)來控制脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)動(dòng)員，而且還可以通過抑制炎性因子和炎性介質(zhì)的活性來負(fù)向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，從而降低脂毒性［12-13］。Kato等［14］研究顯示，PPAR-γ激動(dòng)劑厄貝沙坦通過激活PPAR-γ，降低固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（sterol regulatory element binding protein-1，SREBP1）表達(dá)、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的水平，改善胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)，從而減輕肥胖ob/ob小鼠脂肪肝及肝損傷。

Fig.4 Effects of irbesartan on the expression of the autophagosome marker LC3B detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測(cè)厄貝沙坦對(duì)自噬標(biāo)志蛋白LC3B表達(dá)的影響

Fig.5 Irbesartan increased the expression of LC3B observed by confocal microscopy圖5 激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)厄貝沙坦對(duì)LC3B表達(dá)的影響

Fig.6 Comparison of LC3B expression levels detected by laser confocal technique between the four groups圖6 激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)各組LC3B表達(dá)水平的比較

AMPK主要在真核細(xì)胞生物中發(fā)揮“能量調(diào)節(jié)器”的作用，并參與調(diào)節(jié)體內(nèi)糖、脂代謝及胰島素分泌，在NAFLD發(fā)病機(jī)制和治療過程中起到至關(guān)重要的作用。既往研究證實(shí)，AMPK作為能量感受信號(hào)的中繼站，可將細(xì)胞內(nèi)的能量信號(hào)匯聚至mTOR，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)腺苷三磷酸（ATP）生成減少，p-AMPK可以通過抑制mTOR磷酸化，繼而增強(qiáng)自噬，促進(jìn)分解代謝［15］。自噬是細(xì)胞在應(yīng)激情況下所做出的一種非損傷性應(yīng)答反應(yīng)，其通過對(duì)自身胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)和（或）細(xì)胞器進(jìn)行包裹吞噬形成自噬體，進(jìn)一步與溶酶體發(fā)生融合形成自噬溶酶體，最終將吞噬物降解。自噬可降解并清除細(xì)胞內(nèi)受損或衰老的細(xì)胞器及錯(cuò)誤折疊蛋白，從而維持細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能正常以及減緩細(xì)胞的衰老。近來研究已證實(shí)，自噬除了降解肝細(xì)胞內(nèi)過多或損傷的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)外，還介導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的代謝和分解，促進(jìn)脂滴內(nèi)貯存脂質(zhì)的降解［12，16］。因此，自噬的缺失會(huì)降低肝臟脂質(zhì)輸出，從而誘導(dǎo)肝臟脂肪變的發(fā)生與加重；反之，肝臟自噬被激活，則通過其吞噬作用調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂代謝，有助于減輕肝臟脂毒性，從而治療脂肪肝，并減緩或阻斷其向肝纖維化、肝硬化以及其他嚴(yán)重肝損傷的發(fā)展。

綜上所述，厄貝沙坦防治脂肪肝的作用機(jī)制可能與其激活PPAR-γ介導(dǎo)的AMPK/mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)肝細(xì)胞的自噬有關(guān)。