甘珀酸抑制eATP-P2X7R-NLRP3信號通路減輕慢性胰腺炎纖維化的實驗研究

張桂賢，王曼雪，劉大衛，劉洪斌△，聶衛，石釧

慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）是基因突變、毒性代謝、自身免疫、胰管狹窄等多因素參與的病理性炎癥綜合征，也是一種以腺泡細胞破壞、進行性纖維化為主要特征的疾病［1］。臨床上主要表現為反復發作的上腹部疼痛和胰腺內、外分泌功能不全。患者生活質量較低，且該病發病率有逐年上升的趨勢。胰腺炎是全球因病死亡的主要原因之一，其中急性胰腺炎病死率為30%，CP病死率為50%［2］。目前，亟需認識CP進展的潛在機制，以確定基于新機制的治療靶點。

抑制胰腺炎癥和纖維化可有效緩解CP的臨床癥狀，是防止CP惡變的有效手段。筆者前期研究發現，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 3，NLRP3）炎性體是多種慢性炎癥反應的中心環節，不僅與肺纖維化［3］、腎間質纖維化［4］和肝纖維化［5］等相關，也與CP胰腺纖維化有著十分密切的關系。腺苷三磷酸（ATP）是最豐富的受體家族之一，參與細胞通訊與信號傳遞。嘌呤能2X7受體（purinergic 2X7 receptor，P2X7R）是ATP唯一的生理性、配體門控的離子通道受體，在膠質細胞上高表達［6］。當宿主細胞受到損傷而發生壞死時，細胞中的ATP等分子會釋放到胞外，細胞外ATP（extracellular ATP，eATP）是重要的損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）分子，能夠激活細胞表面P2X7R，打開其介導的離子通道，使K+外流，并能夠通過胞外的縫隙連接蛋白1（pannexin-1，PAN-1）在細胞膜形成小孔［7］，使一些NLRP3的配體通過小孔進入細胞內而啟動NLRP3炎性體的裝配［8］。本研究采用雨蛙素反復注射制備小鼠CP模型，以eATP抑制劑甘珀酸（carbenoxolone，CBX）通過抑制PAN-1影響ATP的釋放對模型進行干預，觀察能否通過eATP-P2X7R-NLRP3信號通路對胰腺炎癥和纖維化的進程產生影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 雨蛙素、甘珀酸購自美國Sigma公司；ATPlite一步發光檢測試劑盒購自美國Perkinelmer公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）、P2X7R、NLRP3抗體購自美國Novus公司；PAN-1抗體購自美國Abcam公司；GAPDH抗體、熒光二抗（紅、綠）購自美國CST公司；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qPCR）所需一系列試劑盒均購自美國Thermo fisher公司。

1.1.2主要儀器 DM4000B型研究級顯微鏡、RM2235/2245型切片機、ASP300全自動組織脫水機及DM750P型偏振光顯微鏡均購自德國Leica公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物 6周齡SPF級健康雄性C57BL/6小鼠50只，體質量（21±1）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（批號：11400700185632）。實驗前動物進行適應性喂養1周，于動物中心屏障級動物室內飼養，每籠5只。實驗過程中動物自由攝食、飲水，12 h交替照明，室溫（23±2）℃，相對濕度（55±5）%。

1.2.2模型制作與分組 50只小鼠按隨機數字表法分為正常組，模型組，CBX低、中、高劑量組，每組10只。除正常組外，其他組實驗動物采用反復腹腔注射雨蛙素的方法制作小鼠CP模型，單次注射劑量為50 μg/kg，每小時給藥1次，6次/d，每周一、三、五注射，連續6周。最后一次注射雨蛙素后，CBX各劑量組小鼠分別予以CBX（25、50、100 mg/kg）腹腔注射，連續2周。模型組腹腔注射與給藥組等頻次、等體積的生理鹽水，2周。正常組在整個8周研究期間均腹腔注射與給藥組等頻次、等體積生理鹽水。末次給藥24 h后將小鼠脫頸處死。小心剪開腹腔后，分離胰腺組織。

1.2.3胰腺組織HE染色及炎癥損傷程度評分 將10%中性福爾馬林溶液固定的胰腺組織按標準方法進行石蠟包埋，4μm切片，染色。胰腺損傷的嚴重程度由病理醫師采用盲法在未知分組的情況下，每只小鼠隨機抽取任意部位的病理切片3張，每張組織切片讀取10個不同視野，對胰腺組織炎癥細胞浸潤、腺泡萎縮及纖維化程度的病理改變進行評分。

1.2.4組織中eATP含量測定 將小鼠胰腺組織從液氮中取出，每只稱取20 mg放至2 mL離心管中，剪碎。每管加入1mL組織培養液（其中含青霉素200 U、鏈霉素200 μg、慶大霉素10 μg），室溫放置5 min。PBS洗滌3次后，加入10倍體積PBS，CO2培養箱中37 ℃ 1 h，離心6 000×g5 min取上清，備用。按ATP標準品標識加入960 μL蒸餾水配制為10 mmol/L儲存液。10倍等比稀釋儲存液至1 μmol/L～1 pmol/L。將標準品等比稀釋系列每孔50 μL添加至黑色96孔板，然后加入50 μL底物溶液。另取一列，每孔添加50 μL樣品上清液，然后加入50 μL底物溶液。微量振蕩器避光振蕩30 s。將96孔板放置于熒光/化學發光檢測儀讀板。按照Wan等［9］的ATP化學發光法測定組織eATP。

1.2.5胰腺P2X7R、NLRP3和Caspase-1免疫熒光染色 將胰腺組織標本切片、脫蠟、微波抗原修復、山羊血清封閉以減少非特異性染色，一抗孵育過夜，PBS漂洗3次，每次5 min。加入二抗避光孵育1.5 h，PBS漂洗3次，每次5 min。DAPI復染及封片，熒光顯微鏡觀察組織中P2X7R、NLRP3和Caspase-1表達，使用Leica LAS Extended Annotation模塊的軟件進行處理及定量分析。蛋白表達量以累積光密度（IOD）值表示。

1.2.6qPCR反應檢測胰腺中P2X7R、NLRP3、Caspase-1和PAN-1的mRNA表達 以Trizol試劑，從冷凍的胰腺組織中提取總RNA。通過Nanodrop檢測RNA純度及濃度。用反轉錄試劑進行反轉錄合成cDNA，再進行PCR擴增，檢測mRNA的表達水平。PCR反應體系為：預混SYBR Mix 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.6 μL，總體系共20 μL。擴增條件：95 ℃預變性15 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個循環。引物序列使用NCBI網站Primer-BLAST在線設計，具體序列如表1所示。閾值循環數測定采用iCycler軟件1.0版本（Bio-Rad）。將各樣品cDNA 10倍稀釋后取2 μL作模板，分別用目的基因引物和內參基因（GAPDH）引物進行擴增，每組重復8次，在60～95℃通過熔解曲線對擴增產物進行驗證。采用2-ΔΔCT方法對每個基因mRNA的相對豐度變化進行計算。

1.3統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

Tab.1 Primer sequence for amplification reaction表1 擴增反應所需引物序列

2 結果

2.1 胰腺慢性炎癥損傷組織學評分 光鏡下，正常組小鼠胰腺細胞分布緊密、結構清晰、胞漿豐富、胰島數目較多且胰管無組織學改變。與正常組相比，模型組可見明顯的慢性炎癥及纖維化，表現為胰腺結構異常、腺泡萎縮、炎癥細胞浸潤和纖維化，胰島結構破壞且數量減少，胰管擴張；與模型組相比，CBX各劑量組炎癥和纖維化程度均有不同程度減輕，高、中劑量組變化顯著。且隨著劑量的增加，細胞間隙減少、胰管擴張減輕、膠原纖維含量降低及炎癥細胞浸潤減少等變化越來越明顯。見圖1、表2。

Tab.2 Comparison of histopathological scores of the pancreas between five groups表2 各組小鼠胰腺病理組織學評分比較（n=10，分，±s）

Tab.2 Comparison of histopathological scores of the pancreas between five groups表2 各組小鼠胰腺病理組織學評分比較（n=10，分，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與CBX低劑量組比較，d與CBX中劑量組比較，P＜0.05

組別正常組模型組CBX低劑量組CBX中劑量組CBX高劑量組F炎癥細胞浸潤0 3.39±0.37a 3.17±0.11a 2.96±0.22abc 1.86±0.38abcd 273.863＊＊腺泡萎縮0 2.62±0.25a 2.43±0.16a 2.19±0.19abc 1.71±0.44abcd 272.455＊＊纖維化0 3.17±0.39a 2.88±0.34a 2.81±0.32abc 1.77±0.42abcd 150.684＊＊

2.2 CP小鼠胰腺組織eATP水平 與正常組相比，模型組eATP水平顯著升高；與模型組相比，CBX中、高劑量組eATP水平有不同程度下降。見圖2。

2.3 免疫熒光分析P2X7R、NLRP3、Caspase-1蛋白表達 與正常組相比，模型組P2X7R、NLRP3、Caspase-1平均光密度均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，CBX中、高劑量組P2X7R、NLRP3、Caspase-1平均光密度均有所下降（P＜0.05），見表3、圖3。

2.4 胰腺中P2X7R、NLRP3、Caspase-1和PAN-1mRNA表達 與正常組比較，模型組小鼠胰腺組織中P2X7R、NLRP3、Caspase-1、PAN-1 mRNA水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，CBX中、高劑量組P2X7R、NLRP3、Caspase-1、PAN-1 mRNA水平均下調，高劑量組低于中、低劑量組。見圖4。

Fig.1 Pathological observation of chronic inflammatory injury and fibrosis of pancreas in five groups(HE,×200)圖1 小鼠胰腺組織慢性炎性損傷及纖維化病理組織學觀察（HE，×200）

Tab.3 Immunofluorescence quantitative analysis of P2X7R,NLRP3 and Caspase-1 in mouse pancreas表3 小鼠胰腺P2X7R、NLRP3、Caspase-1蛋白表達免疫熒光定量分析 （n=10，IOD，±s）

Tab.3 Immunofluorescence quantitative analysis of P2X7R,NLRP3 and Caspase-1 in mouse pancreas表3 小鼠胰腺P2X7R、NLRP3、Caspase-1蛋白表達免疫熒光定量分析 （n=10，IOD，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與CBX低劑量組比較，d與CBX中劑量組比較，P＜0.05

組別正常組模型組CBX低劑量CBX中劑量CBX高劑量F P2X7R 0.021±0.007 0.143±0.013a 0.125±0.031a 0.114±0.033abc 0.071±0.010abcd 51.695＊＊NLRP3 0.029±0.006 0.186±0.056a 0.147±0.024a 0.127±0.035ab 0.082±0.024abcd 33.552＊＊Caspase-1 0.028±0.005 0.169±0.022a 0.146±0.027a 0.136±0.029ab 0.085±0.021abcd 63.794＊＊

3 討論

3.1 eATP可作為DAMP分子在多種疾病中發揮重要作用 近年來，DAMP分子在炎癥、組織修復中的作用備受關注。除了細胞內組分，如組蛋白、高遷移率族蛋白1外，細胞外組分eATP也已證明可作為DAMP分子通過旁分泌或自分泌途徑介導細胞增殖、細胞毒性、炎癥和細胞凋亡。

在正常生理條件下，eATP水平是各種細胞功能的基礎，其穩態濃度為0～10 nmol/L。若其過度釋放，則可引起大量的病理反應，對人類疾病產生影響，如eATP分子觸發炎癥級聯信號傳導及炎性小體的裝配，在多種慢性炎癥和纖維化疾病，如結腸炎、肺纖維化和腎纖維化發病機制中起重要作用［10］。有研究證實，當eATP濃度達到100 μmol/L或以上時，就會啟動P2X7R的活化。P2X7R是由免疫細胞，特別是巨噬細胞特異性表達的，其活化可以誘導免疫細胞的生物活性，如增強吞噬作用、誘導炎癥小體形成、提高促炎細胞因子的釋放等。需要注意的是，eATP與P2X7R結合不僅可使非選擇性陽離子通道開放，還可誘導質膜通透并形成半通道PAN-1，促進NLRP3炎性體裝配。不僅如此，eATP也參與促進纖維化信號的傳導。阻斷eATP介導的嘌呤能信號傳導，減少膠原合成，從而抑制或阻止纖維化進展。隨著胰腺纖維化程度的加重及腺泡細胞的破壞，eATP水平迅速增加［11］。因此，eATP的動態監測可以作為評估胰腺纖維化程度的重要參考。

Fig.3 Immunofluorescence staining of P2X7R,NLRP3 and Caspase-1 in five groups(×200)圖3 各組小鼠P2X7R、NLRP3、Caspase-1免疫熒光染色圖（×200）

Fig.4 Comparison of the relative expressions of P2X7R,NLRP3,Caspase-1 and PAN-1 mRNA in pancreas between five groups of mice圖4 各組小鼠胰腺組織中P2X7R、NLRP3、Caspase-1和PAN-1 mRNA相對表達量比較

3.2 CBX在炎癥級聯反應中的作用 PAN-1是縫隙連接蛋白家族的成員之一，可促進機械敏感性ATP和Ca2+信號釋放。CBX是PAN-1的拮抗劑，中文別稱為生胃酮，是一種傳統的抗潰瘍藥。研究表明，CBX可通過刺激腎上腺或增加內源性皮質類固醇分泌而產生抗炎作用［12］。目前認為CBX是哺乳動物細胞系中最有效的PAN-1半通道抑制劑，可直接與縫隙連接通道結合，導致縫隙連接處的構象變化和半通道的閉合［13-14］。CBX可通過阻斷eATP的釋放，抑制eATP級聯信號觸發P2X7R反饋的K+外流，間接抑制NLRP3炎性體的組裝。

3.3 NLRP3炎性體活化與CP纖維化的關系 NLRP3炎性體由NLRP3蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和Caspase-1前體組成。P2X7R介導NLRP3炎性體激活可活化Caspase-1，促進促炎因子白細胞介素（IL）-1β、IL-18的成熟和釋放［15］。IL-1β、IL-18是重要的促炎細胞因子，它們參與驅動炎癥反應及維持動態平衡。NLRP3也被認為是細胞失衡的傳感器，其激活劑可造成廣泛的組織損傷。

本研究中，采用雨蛙素反復注射刺激后，eATP濃度顯著增加，而HE染色結果顯示，模型組發生了明顯的炎癥及纖維化；免疫熒光染色結果證實P2X7R、NLRP3和Caspase-1的表達明顯升高，表明小鼠纖維化變化與eATP-P2X7R-NLRP3信號途徑中的eATP水平變化和PAN-1、P2X7R、NLRP3及Caspase-1蛋白表達變化趨勢一致；在使用ATP拮抗劑CBX治療后，各劑量組胰腺炎癥和纖維化均減輕，表明拮抗劑CBX對NLRP3炎性體信號通路有抑制作用，提示eATP在CP及其纖維化進程中發揮了重要作用。

綜上所述，CP是動態性、纖維性胰腺炎癥疾病，胰腺纖維化是復發性胰腺損傷后重塑的結果，但CP纖維化在早期階段是可逆的。eATP作為重要的DAMP分子，可通過促進NLRP3炎性體上游信號的激活，引起促炎因子的釋放并參與CP胰腺纖維化進程，通過抑制PAN-1介導的ATP釋放可顯著抑制NLRP3炎性體的組裝及胰腺纖維化，提示PAN-1抑制劑CBX可能在CP胰腺纖維化治療中發揮作用。

（圖1、3見插頁）