鐵離子沉積在急性CO中毒遲發性腦病白質脫髓鞘中的作用

高葉，韓琴，雷蕊綺，蔣力，扶孟，嚴湘，李經倫

急性一氧化碳（CO）中毒是臨床上常見的中毒原因之一。有10%～30%患者在經歷2～6周的“假愈期”后，出現以認知功能障礙等為主的一系列神經精神癥狀，稱為急性CO中毒遲發性腦病（delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP），其發病機制尚未完全明確，但白質彌漫性的脫髓鞘改變是其最常見的病理變化之一［1］，且白質進行性脫髓鞘被認為是引發DEACMP機制之一［2］。鐵離子除了參與氧氣的運輸、DNA等物質合成外，還參與了神經髓鞘的合成［3］。少突膠質細胞（OLs）是主要的含鐵細胞，也是中樞神經系統髓鞘形成細胞，在髓鞘的形成和修復中起著關鍵的作用。研究發現過量沉積的鐵離子可通過氧化應激等途徑損傷OLs和髓鞘結構［4］。同時，新生兒缺血缺氧性腦損傷（HIBD）后可觀察到在白質脫髓鞘區出現明顯的鐵沉積現象［5-6］；而在使用鐵離子螯合劑后，HIBD動物遲發性腦損傷明顯緩解［7］。DEACMP也存在遲發性腦損傷，但鐵離子沉積與DEACMP白質脫髓鞘的關系暫不明確。因此，本研究通過建立DEACMP大鼠模型并檢測其腦組織內鐵離子、鐵蛋白（Fn）、OLs特異性表達蛋白2′，3′-環核苷酸磷酸二酯酶（CNPase）以及髓鞘堿性蛋白（MBP）的動態變化探討鐵離子沉積在DEACMP發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及材料 SPF級成年雄性健康SD大鼠165只，體質量220～300 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證：SCXK（川）2019-030；99.9%體積分數的CO氣體購自西南化工研究所；Morris水迷宮跟蹤分析系統由西南醫科大學公共衛生學院提供；去鐵胺（DFO）試劑購自瑞士諾華制藥有限公司；兔源 MBP抗體（ab62631）、Fn抗體（ab45688）、CNPase抗體（ab227218）和GAPDH一抗均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔抗體和蘇木素染液購自Aspen公司；DAPI染液及抗熒光淬滅封片劑購自武漢阿斯本生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；血氣分析儀購自雅培公司；顯微鏡購自OLYMPUS公司。

1.2方法

1.2.1分組及造模 將經水迷宮實驗篩選后的165只大鼠按隨機數字表法分為：空氣對照組（AC組）、CO中毒組（CO組）、DFO+CO中毒組（DC組），每組50只；每組再分為5個亞組，即染毒1、3、7、14、21 d組，另取備用大鼠15只。將大鼠稱質量后，CO組、DC組大鼠首劑腹腔注射CO氣體100 mL/kg，后每隔4 h追加注射50 mL/kg CO氣體3次，AC組按同等間隔時間注射等量的空氣。DC組在造模前1 h腹腔注射去鐵胺100 mg/kg，造模后每日1次，直到處死；AC組、CO組每日給予相應體積生理鹽水腹腔注射。染毒后于各時間點使用血氣分析儀檢測大鼠股動脈碳氧血紅蛋白（HbCO）濃度。

1.2.2Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力 水迷宮實驗主要分為定位航行（檢測大鼠學習能力）和空間探索（檢測大鼠記憶能力）。定位航行實驗：將水迷宮設置4個象限，把平臺隨機定于任一象限，平臺高出水面1.5 cm，將大鼠頭朝池壁中點分別從4個象限放入水中，記錄大鼠從入水至爬上平臺時間，每次時間設定為120 s。如若大鼠在120 s內未找到平臺，則逃避潛伏期為120 s。空間探索實驗前撤去平臺，記錄大鼠在120 s穿過目標平臺所在象限次數。實驗前連續訓練大鼠6 d，淘汰有認知功能障礙的大鼠。各組大鼠再分別于染毒前及染毒3、7、14、21 d行上述兩項檢測，記錄數據。

1.2.3標本采集 各組大鼠于染毒相應時間點行水迷宮實驗后，將大鼠麻醉，一半數量的大鼠進行心臟灌注、固定取腦白質，制成石蠟切片用于染色；另一半分離出新鮮腦白質用于Western blot檢測。

1.2.4HE染色觀察細胞形態 常規包埋切片，切片脫蠟至水，蘇木素染色細胞核，伊紅染色細胞質，脫水封片觀察大鼠染毒14 d時神經細胞形態學變化。

1.2.5普魯士藍染色觀察鐵離子表達 組織包埋、切片，切片脫蠟至水，經染鐵元素染色后水洗，再置于核固紅染液浸染、水洗，最后脫水封片。400倍顯微鏡下觀察，每張切片用隨機數字表法取皮質區5個不重疊視野，用Image Pro plus 6.0軟件計算其平均吸光度值，進行分析。

1.2.6Western blot檢測Fn、MBP蛋白表達 白質區腦組織加入蛋白提取試劑，冰浴后均漿，4℃12 000 r/min離心5min，收集上清，用BCA測定蛋白濃度加入蛋白上樣緩沖液，95～100 ℃沸水浴5 min，經凝膠電泳，轉膜、封閉，加入Fn（1∶500）、MBP（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗4 ℃過夜孵育，TBST洗膜3次后加入HRP標記的二抗（1∶10 000）室溫孵育30 min，TBST漂洗4次，再化學發光檢測、處理分析目標帶的灰度值。

1.2.7免疫組化染色檢測CNPase蛋白表達 切片脫蠟水化、經PBS液沖洗后置于EDTA緩沖液中微波修復冷卻，再放于3%過氧化氫液中室溫下避光孵育10 min，PBS漂洗甩干后置于5%BSA中封閉20 min，加入CNPase（1∶200）4 ℃過夜，HRP標記的二抗（1∶200）室溫孵育50 min，DAB顯色沖洗后蘇木素復染、乙醇分化、氨水返藍、梯度乙醇脫水干燥后封片鏡下觀察。顯微鏡下每張切片在皮質區隨機讀取5個視野進行觀察，用Image Pro plus 6.0軟件分析視野內陽性區域的平均吸光度值。

1.2.8免疫熒光染色檢測MBP蛋白表達 切片脫蠟水化、經PBS液沖洗后置于EDTA緩沖液中微波修復冷卻，再放于3%過氧化氫液中室溫下避光孵育10 min，PBS漂洗甩干后置于5%BSA封閉20 min，加入MBP（1∶1 000）一抗4℃過夜，HRP標記的二抗（1∶10 000）37 ℃孵育50 min，漂洗后加50～100μL DAPI染液，室溫避光孵育5 min，滴加抗熒光淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察。

1.3統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示；水迷宮實驗數據采用重復測量方差分析，余數據采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學表現及HbCO濃度檢測結果 首劑染毒后多數大鼠出現煩躁不安、沖撞鼠籠，大鼠口唇及四肢皮膚黏膜可見櫻桃紅色改變，少數則表現為精神萎靡，四肢癱軟；追加CO氣體劑量后，大鼠陸續出現四肢強直、抽搐，甚至昏迷、死亡。共8只死亡，其中CO組6只，DC組2只；死亡大鼠用備用大鼠采用相同造模方法補齊。染毒前各組大鼠動脈血HbCO濃度均小于1%，染毒后16 h內測得的CO組、DC組HbCO濃度持續大于50%。

2.2 Morris水迷宮實驗結果 CO組大鼠染毒14 d、21 d的逃避潛伏期較造模前、染毒3 d、7 d明顯延遲；染毒14 d、21 d，CO組、DC組逃避潛伏期較AC組延長，DC組逃避潛伏期較CO組縮短（P＜0.05），見表1。CO組大鼠在14 d、21 d時穿越平臺次數較AC組及DC組明顯減少（P＜0.05），見表2。

Tab.1 Comparison of escape latency at each time point between three groups of rats表1 3組大鼠各時間點逃避潛伏期比較 （n=3，s，±s）

Tab.1 Comparison of escape latency at each time point between three groups of rats表1 3組大鼠各時間點逃避潛伏期比較 （n=3，s，±s）

F時間=816.606＊＊，F組別=3184.379＊＊，F交互=211.442＊＊；＊＊P＜0.01，a與AC組相比，b與CO組相比，c與CO組內造模前及染毒3 d、7 d相比，P＜0.05

組別AC組CO組DC組造模前11.27±0.08 11.33±0.22 11.34±0.24 3 d 11.32±0.20 11.36±0.28 11.35±0.30 7 d 11.24±0.08 11.29±0.21 11.37±0.26 14 d 11.40±0.14 22.09±0.54ac 19.91±0.39ab 21 d 11.19±0.19 21.50±0.51ac 19.31±0.65ab

2.3 HE染色 光鏡下可見AC組大鼠腦白質區神經元結構正常，核仁及核膜結構清晰，未見變性壞死細胞；CO組大鼠神經細胞隨著染毒時間的推移發生變性、壞死，表現為神經元腫脹，胞體皺縮，核仁偏位，胞質深染，細胞核固縮、碎裂，胞質與胞核界限不清；DC組細胞變性、壞死介于AC、CO組之間，見圖1。

Fig.1 The HE staining in white matter area at the 14th day(×400)圖1 第14天白質區HE染色（×400）

Tab.2 Comparison of the number of platform crossing at each time point between three groups of rats表2 3組大鼠各時間點穿越平臺次數比較（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of the number of platform crossing at each time point between three groups of rats表2 3組大鼠各時間點穿越平臺次數比較（n=6，±s）

F時間=19.129＊＊，F組別=21.735＊＊，F交互=3.543＊＊；＊＊P＜0.01，a與AC組相比，b與CO組相比，c與CO組內造模前及染毒3 d、7 d相比，P＜0.05

組別AC組CO組DC組造模前5.17±1.17 5.17±0.98 5.17±1.17 3 d 5.00±0.63 4.50±1.05 4.67±1.03 7 d 4.67±1.21 3.67±1.03 4.33±0.52 14 d 4.67±1.03 1.33±1.21ac 3.00±0.63ab 21 d 4.33±0.82 1.50±0.55ac 3.17±0.75ab

2.4 普魯士藍染色 CO組大鼠白質區鐵離子被染成亮藍色，呈團塊樣分布。AC組鐵離子表達極少，各時間點間差異無統計學意義（P＞0.05）；CO組鐵離子表達于染毒14 d達到高峰（P＜0.05）。與AC組比較，CO組、DC組鐵離子表達增加；與CO組比較，DC組鐵離子表達減少（P＜0.05），見圖2、表3。

Fig.2 The prussian blue staining in white matter area at the 14th day(×400)圖2 第14天白質區普魯士藍染色（×400）

Tab.3 The expression of iron detected by Prussian blue staining表3 普魯士藍染色檢測鐵離子表達情況 （n=3，±s）

Tab.3 The expression of iron detected by Prussian blue staining表3 普魯士藍染色檢測鐵離子表達情況 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與AC組相比，b與CO組相比，c與CO組內14 d相比，P＜0.05

組別AC組CO組DC組F 1 d 8.90±0.72 14.73±0.89ac 11.63±0.89ab 36.097＊＊3 d 8.47±0.61 21.98±1.61ac 14.89±1.82ab 65.245＊＊7 d 7.31±0.99 32.38±1.60ac 16.33±1.63ab 234.609＊＊組別AC組CO組DC組F 14 d 7.79±1.17 43.56±3.34a 19.12±0.93ab 224.612＊＊21 d 7.99±0.90 32.51±2.19ac 17.16±1.47ab 178.120＊＊F 1.407 83.697＊＊12.008＊＊

2.5 Western blot結果 CO組、DC組Fn表達均在7d達峰值，后逐漸減少；除1 d外，與AC組比較，CO組、DC組Fn表達增加；與CO組比較，DC組Fn表達減少（P＜0.05）。CO組大鼠于染毒3 d后MBP表達逐漸減少，14 d表達最少；與AC組比較，染毒3 d后CO組、DC組MBP表達減少；與CO組比較，染毒3 d后DC組MBP表達增加（P＜0.05），見圖3。

2.6 CNPase免疫組化染色 CO組染毒14 d CNPase陽性表達最少（F=116.834，P＜0.05）。染毒7、14、21 d時，CO組、DC組CNPase表達較AC組減少（P＜0.05）；與 CO組比較，DC組在 14 d和 21 d CNPase表達增多（P＜0.05），見圖4、表4。

2.7 MBP免疫熒光染色 MBP主要表達于白質髓鞘；染毒14 d時，CO組MBP表達較AC組明顯減少，髓鞘排列稀疏且模糊；DC組MBP表達較CO組增加，髓鞘排列較密集，見圖5。

Fig.3 The expressions of Fn and MBP in white matter area detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測白質區Fn、MBP蛋白表達

Tab.4 The comparison of immunohistochemical results of CNPase between three groups表4 3組大鼠CNPase免疫組化結果比較 （n=3，±s）

Tab.4 The comparison of immunohistochemical results of CNPase between three groups表4 3組大鼠CNPase免疫組化結果比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與AC組相比，b與CO組相比，c與CO組內14 d相比，P＜0.05

組別AC組CO組DC組F 1 d 7.03±0.25 7.13±0.35c 6.93±0.45 0.231 3 d 7.37±0.81 6.83±0.40c 7.23±0.49 0.654 7 d 7.33±0.57 5.20±0.30ac 5.70±0.36a 20.620＊＊14 d 7.47±0.74 2.07±0.31a 4.33±0.47ab 76.946＊＊21 d 6.97±0.25 4.57±0.25ac 5.20±0.36ab 54.247＊＊

Fig.4 The immunohistochemical staining of CNPase in white matter area at the 14th day(×400)圖4 第14天白質區CNPase免疫組化染色（×400）

Fig.5 The immunofluorescence of MBP in the brain white matter area at the 14th day(×400)圖5 第14天腦白質區MBP免疫熒光染色（×400）

3 討論

DEACMP發病機制復雜，尚不十分明確，可能是缺血缺氧、炎癥與免疫反應、細胞凋亡、神經遞質紊亂、脫髓鞘等多因素共同作用的結果［8］。本實驗采用改良式腹腔注射CO氣體方法制備DEACMP大鼠模型。染毒后大鼠出現典型的急性CO中毒表現，且體內HbCO濃度持續16 h以上超過50%，達到急性CO中毒標準［9］；染毒7 d、14 d神經元細胞變性、壞死明顯，此時大鼠表現出顯著的學習記憶功能下降；大鼠行為學表現晚于其病理學改變，與臨床患者CO中毒后出現的遲發性腦病在時間及表現上基本一致，說明本實驗造模成功。

腦內鐵離子分布廣泛，Fn是鐵離子在細胞內最主要的儲存場所，其穩態受缺氧、炎癥、損傷、鐵調素等多種因素影響［10］。腦組織發育過程中鐵離子缺乏將導致不可逆的認知和行為障礙，而鐵離子過量沉積可通過芬頓（Fenton）及哈伯·韋斯（Haber-Weiss）反應產生氧化毒性、內質網應激、線粒體功能障礙，增強凋亡信號等作用導致多種中樞神經系統疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病等［11-12］。

OLs是中樞神經系統髓鞘形成細胞，CNPase特定表達于OLs，因此可通過對CNPase表達間接分析腦白質中OLs的變化。MBP是中樞神經髓鞘的主要髓磷脂蛋白（約占40%），其表達可以間接反映白質髓鞘纖維的變化；Wang等［13］研究發現，L-絲氨酸可通過促進白質內OLs分化和髓鞘再生進而改善小鼠的學習、記憶和認知功能。Zhang等［14］研究表明，喹硫平通過促進OLs的再生從而改善脫髓鞘模型小鼠的認知功能。以上研究表明，OLs的功能障礙及髓鞘結構的破壞可能是導致認知功能障礙的重要結構基礎［15］。

有研究發現，在缺氧早期，鐵離子增加可促進Fn表達，Fn可與鐵離子結合，從而中和鐵離子的氧化毒性［4］。而CO中毒晚期機體復氧后可使一氧化氮含量升高，誘導與Fn結合的鐵離子從結合蛋白中游離出來，游離的鐵離子可產生級聯反應導致鐵離子在腦組織內大量蓄積［16］。本研究中，在染毒前期（1 d、3 d），CO組大鼠鐵離子表達逐漸增加的同時Fn表達也在增加；增加的鐵離子和Fn結合，中和了鐵離子的氧化毒性，減輕了OLs和髓鞘結構的損傷，CNPase表達無明顯減少，MBP表達僅輕度減少，白質髓鞘丟失不明顯，此時3組大鼠定位航行和空間探索實驗結果相比均無差異，大鼠學習、記憶功能尚未受到損害。隨著染毒時間的延長，在染毒后期（7、14 d），鐵離子表達迅速增加，Fn表達開始減少，過量沉積的鐵離子通過氧化應激、膜脂質過氧化、蛋白質變性降解等途徑大量損傷OLs及減少髓鞘MBP表達，導致CNPase、MBP表達進行性減少，白質脫髓鞘明顯，14 d、21 d水迷宮實驗發現大鼠出現明顯的學習記憶能力損傷，證實急性CO中毒后，過量沉積的鐵離子可通過損傷OLs及減少MBP表達，導致大鼠腦白質進行性脫髓鞘，發生遲發性認知功能障礙。

DFO是一種可滲透血腦屏障的鐵離子螯合劑，常用于清除腦內過量的鐵離子［17］。本研究發現應用DFO顯著降低染毒14 d、21 d大鼠腦內鐵離子后，DC組大鼠OLs損傷減輕，CNPase和MBP表達增加，明顯減輕了腦白質脫髓鞘，改善了大鼠的神經功能障礙表現，進一步證實了CO中毒后鐵離子沉積參與了DEACMP的發生發展。

綜上，CO中毒后可能通過鐵離子沉積損傷OLs及減少MBP表達，引起白質進行性脫髓鞘，導致DEACMP發生。正常情況下，腦內鐵離子受到嚴格的鐵代謝調節，處于一種相對穩定狀態。腦內鐵離子的攝取、轉運、輸出、儲存、細胞內代謝等都可以引起腦鐵代謝變化［18］。本實驗可觀察到DEACMP大鼠腦鐵離子表達增加，為防治DEACMP提供了新的治療靶點，但鐵離子在其中的具體轉運調控機制還需進一步研究。

（圖 1、2、4、5見插頁）