經多色流式細胞術確診多發性骨髓瘤并發惡性胸腔積液6例臨床特征分析

王夢園 馬莉 管俊

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）為血液系統發病率位居第二位的惡性腫瘤，是起源于B細胞的惡性克隆性漿細胞疾病。通常骨髓瘤細胞僅局限于骨髓，但其也可擴散并滲透到其他部位，如胸膜、淋巴結和肺臟等［1］，從而產生惡性胸腔積液（malignant pleural effusion，MPE）。本研究主要探討由更為敏感的多色流式細胞術（flow cytometry，FCM）確診的6 例MM并發MPE患者的臨床特點、實驗室指標和轉歸情況，旨在強調FCM 對MPE 的診斷價值及增加對MM并發MPE患者臨床特點的認識。

1 材料與方法

1.1 病例資料

分析2016年7月至2019年10月江蘇省蘇北人民醫院經FCM診斷的6例MM并發MPE患者，其中男性4 例，女性2 例，年齡范圍49～72 歲，中位年齡62歲。MM的診斷標準采用國際骨髓瘤工作組（IMWG）指南。胸腔積液的診斷標準為影像學檢查（胸部X線、胸部CT或超聲）發現胸腔積液同時行胸腔穿刺檢查。MPE的診斷則依據胸水脫落細胞學檢查和（或）FCM 檢查。按照Durie-Salmon（DS）分期體系及國際分期系統（ISS）進行分期，按照血清肌酐水平分組。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集患者的臨床資料，包括年齡、性別、分期、分型和出現胸腔積液的時間以及隨訪截至2020年5月1日患者的總生存時間，同時收集患者的實驗室指標，胸水常規、生化及脫落細胞學檢查，對所有胸腔積液進行FCM檢測。

1.2.2 主要試劑及儀器 CD38-FITC/CD56-PE/CD19-PerCP/CD138-APC、CD138-FITC/CD117-PE/CD28-PerCP/CD27-APC、CD200-PE/CD45-PerCP/CD138-APC、κ-FITC/λ-PE/CD138-APC、溶血素、破膜劑，上述試劑均購自美國貝克曼庫爾特公司。Dx?FLEX流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2.3 實驗方法 多色流式細胞法：取新鮮胸腔積液200～500 mL，過濾后以肝素抗凝，以1 000 r/min的速度離心5 min，棄上清液，PBS洗滌2次，細胞沉淀用PBS制成細胞濃度為106/mL的單細胞懸液，分成5管，分別加入100 mL單細胞懸液，1管為空白對照，2、3、4 管 加 入CD38- FITC/CD56- PE/CD19- PerCP/CD138-APC、CD138-FITC/CD117-PE/CD28-PerCP/CD27-APC、CD200-PE/CD45-PerCP/CD138-APC、κ-FITC/λ-PE/CD138-APC 抗體各10 μL，充分混勻，于室溫避光孵育15 min，加入1∶9 配制的溶血素2 mL，避光8 min 后，以1 000 r/min 的速度離心5 min，棄上清液，PBS 緩沖液0.5 mL 再懸浮細胞。第5 管加入1號固定劑，于室溫避光孵育15 min，加1 mL PBS緩沖液震蕩，以1 000 r/min 的速度離心5 min，棄上清液，加入2 號固定劑，靜置5 min，加入κ-FITC/λ-PE/CD138-APC 抗體各10 mL，充分混勻，于室溫避光孵育15 min，加1 mL PBS 緩沖液震蕩，以1 000 r/min 的速度離心5 min，棄上清液，PBS緩沖液0.5 mL再懸浮細胞，用DxFLEX 流式細胞儀進行檢測，采用Cytex?pert 軟件獲取與分析數據。建立FSC/SSC，每管獲取20 000個細胞，根據同型對照分析。檢測細胞CD19、CD38、CD45、CD56、CD138和κ、λ的表達情況。

脫落細胞學檢查：取胸腔積液標本10 mL，1 500 r/min離心5 min，棄上清液留取沉淀物，混勻后制片，經自然干燥后用瑞－姬染色，光鏡下進行細胞學分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。研究中連續變量以±s表示，分類變量以率（構成比）表示，相關性分析雙變量正態分布采用Pearson 相關性分析，不符合雙變量正態分布采用Sperman 相關性分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征

按照ISS 分期：Ⅰ期1 例，Ⅱ期4 例，Ⅲ期1 例。DS 分期：Ⅰ期1 例，Ⅱ期2 例，Ⅲ期3 例。6 例患者均為A 組。分型：IgA-κ 型1 例，IgG-κ 型1 例，IgA-λ 型2例，IgG-λ型1例，κ輕鏈型1例。其中4例為早發性滲出，另外3 例為遲發性滲出，早發性滲出被定義為在MM 診斷時或在第1 個化療周期發生的滲出。遲發性滲出是指在第1個周期化療后發生的滲出［2］，見表1。

2.2 胸腔積液特征

2.2.1 胸腔積液部位及性質 6例MPE患者中，所有患者均出現雙側大量胸腔積液，胸腔積液顏色1例為紅色，1例為淺黃色，4例為黃色。李凡他試驗中4例陽性，2例弱陽性。6例胸水中乳酸脫氫酶（lactate de?hydrogenase，LDH）水平76～1 328 U/L（中位88 U/L），腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）0～51 U/L（中位45 U/L），白細胞17×106～742×106/L（中位135.5×106/L），單個核細胞數13×106～680×106/L（中位124.5×106/L）。6 例患者行胸腔積液脫落細胞學檢查，鏡下見淋巴細胞等炎癥細胞及間皮細胞，均未見癌細胞。

用多色流式細胞儀對6 例患者的胸水進行免疫表型分析，表達的漿細胞分別占有核細胞數的59.10%、0.71%、1.34%、1.90%、0.38%和29.80%。表2總結了6例患者的胸水骨髓瘤細胞免疫表型。

2.2.2 胸水漿細胞百分比與常規實驗室指標相關性分析 分析6 例經FCM 確診的MM 并發MPE 患者胸水漿細胞比例與常規實驗室指標，結果顯示胸水漿細胞比例與胸水總蛋白、白蛋白、球蛋白、LDH水平、ADA 及初診時骨髓漿細胞比例成正相關（P<0.05），與胸水常規紅細胞數、單個核細胞數、白細胞數以及血清血紅蛋白、血小板、總蛋白、白蛋白、LDH 水平、ADA、β2-微球蛋白均無明顯相關性（P>0.05）。見圖1，表3。

2.3 治療及轉歸

隨訪截至2020年5月1日，共有4 例（66.7%）MPE 患者死亡，2 例（33.3%）患者存活。病例1 在確診MPE 17 個月后死于疾病進展。病例2 在第1 次PAD（硼替佐米+多柔比星+地塞米松）方案化療中出現MPE，經3 個療程PCD（硼替佐米+環磷酰胺+地塞米松）方案治療后，胸腔積液基本消失，此后患者未予治療，4 個月后疾病進展，最終死于漿細胞白血病。病例3 出現心肌淀粉樣變，給予PTD 方案（硼替佐米+沙利度胺+地塞米松）化療后胸水未消失，通過FCM找到異常漿細胞，后改為PCD方案，最終死于疾病進展。病例4 入院時即存在MPE，經過2 個療程PTD 方案治療后，患者出現呼吸心跳驟停，心肺復蘇后轉入重癥監護室，最后死亡。病例5 在第1 次PCD方案化療結束后出現MPE，后改為BRD方案（硼替佐米+來那度胺+地塞米松），因出現全身廣泛皮疹，考慮來那度胺過敏，給予BD 方案（硼替佐米+地塞米松）化療，胸腔積液未消失，后未于本院治療，目前仍然生存。病例6經2個療程PCD方案后，胸腔積液基本消失，第3 個療程結束后骨髓示緩解期骨髓象，游離輕鏈陰性，后行第4 個療程PCD 方案化療，游離輕鏈轉陽性，患者要求轉入當地醫院治療，截至隨訪結束日期仍然生存。

表2 6例MM并發MPE患者的胸水免疫表型特征

圖1 病例6胸水流式分析散點圖

表3 胸水漿細胞比例與實驗室指標相關性分析

3 討論

MM為一種漿細胞惡性增殖性疾病，主要表現為CRAB 癥狀：高鈣血癥、腎衰竭、貧血和溶骨性損害，但也有約6%MM患者出現以胸腔積液為主要表現的呼吸困難［3］。MM合并胸腔積液產生的原因主要為鄰近骨骼或腫瘤的胸膜腔受累、縱隔淋巴結浸潤伴淋巴阻塞、胸膜或肺淀粉樣變，同時MM 可并發腎病綜合征、慢性腎功能衰竭、淀粉樣心肌病、感染、低蛋白血癥和肺栓塞，上述癥狀均可導致胸腔積液的發生［4］。骨髓瘤細胞直接累及胸膜腔產生的MPE 極為罕見，發生率<1%。本院報道的MPE 發生率高于既往研究，主要原因可能為對所有MM并發胸腔積液可抽液樣本均進行傳統常規胸水細胞學檢查聯合FCM檢查。

目前，對于MM 并發MPE 的檢查主要包括胸腔積液細胞學檢查，雖然單純的病理涂片具有較高的特異性，但其敏感性較低，涂片的染色質量可能會妨礙脫落細胞學診斷［5］。因此，流式細胞術在診斷MM并發MPE過程中發揮較大作用。

意大利國家癌癥研究所有數據有力地支持FCM作為一種簡單可靠的技術，在胸水樣本中可以明確鑒定腫瘤漿細胞，而且明顯比細胞學檢查更敏感［6］。目前，認為CD138、CD38、CD45、CD19和CD56均是可鑒別良惡性漿細胞的主要免疫表型［7］。本研究運用FCM 檢測，均可從6 例患者胸腔積液中找到漿細胞，但胸腔積液脫落細胞學檢查均未見癌細胞。所有患者CD38及CD138均為陽性，除病例6之外，所有患者CD19均為陰性。病例4雖然κ和λ均為陽性，但κ/λ>4.0，仍有意義。因此，有必要將FCM納入胸腔積液的常規檢查中，其在鑒別胸腔積液良惡性中發揮重要作用。

Zhong等［8］研究發現，23例MM合并MPE患者，其中男性11 例，女性12 例，中位年齡為56.8（37～68歲），大多數患者為IgA 亞型，其次為IgG 亞型。該研究男性患者多于女性，中位年齡62（49～72）歲，與既往研究相似，IgA型占大多數（50%），IgG型占30%，這可能與IgA 骨髓瘤患者13 號染色體缺失發生率較高有關［9］。但因本研究樣本數較少，同時克隆性漿細胞未做分選，6例患者染色體均為正常核型。

MM患者產生MPE往往預示著疾病進展或復發，為疾病進入晚期的表現。先前的報道指出骨髓瘤性積液患者的總生存期（overall survival，OS）明顯少于無骨髓瘤性胸腔積液的患者（P=0.002）［2］。Cho 等［10］研究表明，MM 伴MPE 預后較差，MPE 發生后患者中位生存時間（median OS，mOS）為2.8（0.2～15.6）個月，總死亡率為57.9%。Kamble 等［9］研究發現，13 號染色體缺失在MM 伴MPE 患者中出現率較高，這可能解釋了MPE 與不良預后之間的關系，約90%漿膜腔浸潤的MM 患者在確診后1年內死亡［11］。在本研究中，6 例患者在隨訪結束后，4 例死亡，2 例生存，mOS 為7.5（2～36）個月，MPE 出現后的mOS 為6.5（2～17）個月，研究結果與上述研究基本相符。

目前，骨髓瘤性胸腔積液的治療應以化療聯合胸腔引流為主［9］。胸膜內予以順鉑治療可以緩解MPE 癥狀，但對預后無影響［12］。Ye 等［13］報道1 例以骨髓瘤性胸腔積液為首發癥狀的患者，最初予以Cy?BorD（環磷酰胺+硼替佐米+地塞米松）方案化療。然而，MPE 快速積聚，后來將化療方案更換為硼替佐米+達雷木單抗+地塞米松方案，1個月內胸腔積液基本消失。也有學者研究發現，IgG-κ 亞型MM 并發MPE 的患者，最初對地塞米松有良好的反應［14］。Zhong 等［8］研究發現，MM 并發MPE 的患者對聯合硼替佐米的治療具有一定反應。硼替佐米為一種新型的蛋白酶體抑制劑，具有明顯的抗骨髓瘤活性。然而，硼替佐米可能引起肺損傷，出現肺部并發癥，其中包括胸腔積液［15］。因此，這為應用蛋白酶體抑制劑治療MM并發胸腔積液增加了更多的挑戰［16］。

綜上所述，本研究認為在胸腔積液常規檢查基礎上，亟需聯合更為敏感的FCM 檢查，以便提高MM并發MPE診斷的陽性率，從而更好地判斷預后，指導臨床個體化治療。