結直腸癌免疫微環境中腫瘤相關巨噬細胞的作用*

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，GLOBOCAN 2018數據顯示，全球CRC在兩性中的發病率居惡性腫瘤第3位，其死亡率僅次于肺癌，居第2位［1］。CRC 的發病率在中國男性和女性腫瘤患者中分別位居第5位和第4位，死亡率均位居男性和女性的第5 位［2］。腫瘤微環境（tu?mor microenvironment，TME）由腫瘤細胞、免疫細胞、內皮細胞和細胞外基質等間質成分及其分泌的細胞因子構成［3］。有關TME 的研究已成為抗癌研究的主要領域之一［4］。腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）作為TME 中的關鍵作用者［5］，在乳腺癌［6］、膀胱癌［7］和肝癌［8］等腫瘤中可發揮促腫瘤作用。但是有關TAMs 在CRC 中的作用仍存爭議。本文主要就TAMs 在CRC 中的作用及其作用機制進行綜述，并探討以TAMs為靶點用于CRC免疫治療的可行性。

1 免疫微環境與TAMs

1.1 免疫微環境

腫瘤免疫微環境（tumor immune microenviron?ment，TIME）是間質細胞和免疫細胞沿細胞外基質建立相互作用的復雜網絡。TIME中的間質細胞如內皮細胞、周細胞和癌癥相關成纖維細胞（cancer associat?ed fibroblasts，CAFs）等在腫瘤血管生成、細胞增殖、侵襲和轉移等方面發揮作用；TIME 中的免疫細胞主要包括腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lympho?cytes，TILs）、腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）、自然殺傷細胞（natural killer，NK）、骨髓來源的抑制細胞（myeloid-derived suppres?sor cells，MDSCs）、粒細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）和肥大細胞等［9-10］。雖然免疫系統有抑制腫瘤生長的作用，但腫瘤細胞及其微環境可通過調節免疫細胞的表型及功能，促進腫瘤免疫抑制并實現免疫逃逸［11-12］。

1.2 TAMs

巨噬細胞是一種重要的固有免疫細胞，在維持組織穩態、宿主防御反應和組織修復等方面發揮重要作用［13］。巨噬細胞具有高度的可塑性，在生理微環境的刺激下主要分化為兩種表型：經典激活巨噬細胞即M1型巨噬細胞，由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導分化，其特點是高抗原呈遞能力，可分泌如白介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-12、IL-23、TNF-α、IFN-γ 和活性氧（re?active oxygen species，ROS）等炎性介質，主要發揮殺菌、免疫促進和腫瘤殺傷的作用；替代激活巨噬細胞即M2型巨噬細胞，由IL-4、IL-10、IL-13或糖皮質激素誘導分化，可產生抗炎細胞因子如IL-10和轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等，具有免疫抑制、促進血管生成和基質重塑等作用。M2型巨噬細胞具有4 種亞型：M2a 型由IL-4 和IL-23 誘導分化，M2b 型由LPS 和免疫復合物誘導分化，M2c型由IL-10、TGF-β 和糖皮質激素誘導分化，M2d 型由IL-6誘導分化［14-15］。

在TME中腫瘤細胞和間質細胞分泌的細胞因子的作用下，骨髓來源的外周血單核細胞可被招募到腫瘤部位并分化為TAMs［16］。TME中TAMs的表型和功能與M2d型巨噬細胞相似［15］。

2 CRC中的TAMs

腫瘤細胞分泌CCL2等趨化因子將循環血液中的單核細胞招募到腫瘤部位，并通過外泌體內的RNA等途徑使其表型極化為腫瘤相關巨噬細胞。一方面，TAMs可借助外泌體或分泌多種細胞因子與腫瘤細胞相互作用，促進腫瘤細胞增殖、血管生成、侵襲和轉移等，從而發揮促腫瘤作用；另一方面，TAMs可分泌趨化因子招募并激活T細胞發揮抗腫瘤免疫作用，而TAMs內的含自水解酶域蛋白5（abhydrolase domain containing 5，ABHD5）還可通過抑制基質金屬蛋白酶（matrix metal?lopeptidase，MMP）發揮抗腫瘤作用。CRC中TAMs的來源、表型極化及其與CRC細胞的相互作用，見圖1。

2.1 CRC微環境招募TAMs

趨化因子配體2（C-C motif ligand 2，CCL2），是招募單核細胞到CRC 微環境中的主要趨化因子之一［17］。SW480細胞系表達的殼多糖酶3樣蛋白1（Chi?tinase 3-like 1，CHI3L1）可通過MAPK信號通路（尤其是ERK 和JNK）的激活，促進腫瘤細胞分泌CCL2 和IL-8（CXCL8），從而募集單核細胞到TME［18］。另一項體外實驗研究表明［19］，人外周血單核細胞和人單核細胞系THP-1 均表達CCR6，而CRC 細胞分泌的CCL20 作為CCR6 配體可促進單核細胞募集到TME。值得注意的是，該項研究證實了CCL20對單核細胞遷移能力的影響與CCL2 相似，這表明CCL20-CCR6的相互作用對CRC微環境招募TAMs發揮重要作用。另外，肝再生磷酸酶-3（phosphatase of regener?ating liver-3，PRL-3）可促進CRC 細胞分泌CCL26，CCL26 通過與TAMs 細胞膜表面的趨化因子受體CCR3相結合，募集TAMs到TME［20］。

圖1 CRC中腫瘤相關巨噬細胞的來源、表型極化及其在TME中的作用

2.2 CRC中TAMs的表型極化

TME中TAMs的表型與腫瘤生長所處階段相關，在腫瘤形成的早期階段，TAMs 以IL-12 高、IL-10 低的M1 表型為主，主要發揮抑制腫瘤血管生成，激活腫瘤免疫的作用；在腫瘤晚期進展階段，微環境中的TAMs以IL-12低、IL-10高的M2表型為主，可增加腫瘤血管生成能力，具有致瘤活性［5，13］。CRC 微環境中的TAMs 具有高度可塑性，通常表現為M2 表型參與腫瘤進展。體外共培養巨噬細胞系THP-1和人結腸癌細胞系DLD-1后，M2型TAMs細胞數量顯著增加，進一步機制研究表明，CRC 細胞外囊泡分泌的miR-145 被巨噬細胞吸收后，靶向組蛋白去乙?；?1（histone deacetylase 11，HDAC11）和Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4），從而誘導TAMs向M2表型的極化［21］。同樣，CRC 細胞來源的外泌體可將長鏈非編碼RNA RPPH1 運輸到TAMs，促進TAMs 向M2 表型極化［22］。此外，CRC 的發生常與腸道菌群的組成和結構改變有關。有關研究顯示［23］，具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，Fn）可通過TLR4依賴的方式激活巨噬細胞中的IL-6/p-STAT3/c-MYC 信號通路，從而促進TAMs向M2表型極化。

2.3 TAMs與CRC預后的關系

TAMs 在CRC 中的作用仍存爭議，有文獻顯示TAMs與CRC患者較好的預后相關，而另有研究認為TAMs 與CRC 患者較差的預后相關，有報道指出TAMs在CRC中發揮雙向作用，相關文獻匯總見表1。

表1 TAMs與CRC預后關系的文獻報道

多項研究表明，CD68+TAMs大多分布在CRC腫瘤間質，主要集中于侵襲前緣，而該部位浸潤的CD68+TAMs可改善CRC患者的預后［24-26］。Malesci等［27］報道，腫瘤侵襲前緣高密度的CD68+TAMs與接受5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）輔助治療的Ⅲ期CRC患者的預后改善相關，這提示TAMs對CRC患者預后的影響也體現在以5-FU為基礎的輔助化療上。

有研究顯示，CD68+TAMs 和M2 型TAMs 的浸潤與CRC 患者的不良預后相關［17，20，28-30］。在一項納入123 例貝伐珠單抗（bevacizumab）聯合化療的晚期CRC患者的回顧性研究中［31］，腫瘤間質低浸潤CD68+TAMs的CRC患者，其無進展生存期和總生存期明顯延長，這提示腫瘤間質中CD68+TAMs 浸潤數量的增加可能會降低晚期CRC患者貝伐珠單抗聯合化療的療效。

然而，不同類型和定位的TAMs對CRC患者的預后意義也因疾病的不同階段而不同。Algars 等［32］分析了包括Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期CRC患者在內的159例腫瘤組織標本，結果表明Ⅱ、Ⅲ期CRC 患者瘤周的M2 型TAMs（CLEVER-1+/Stabilin-1+）增加與預后改善顯著相關，但Ⅳ期CRC 患者瘤內和瘤周的M2 型TAMs均與患者的不良預后相關。同樣，不同類型的TAMs對CRC 肝轉移患者預后的影響也不盡相同，一項涉及120 例CRC 患者（分為低、中、高肝轉移能力3 組）的回顧性研究［33］顯示，M1 型TAMs 與CRC 淋巴轉移和肝轉移能力呈負相關，M2 型TAMs 與CRC 患者術前CEA 水平、淋巴轉移、肝轉移能力呈正相關；且隨著CRC肝轉移能力的增加，M1型TAMs的數量減少，M2型TAMs的數量和M2/M1比值增加，這提示TAMs對CRC 肝轉移的影響不依賴于CD68+TAMs 的總數，而依賴于其功能亞型M1 和M2 型TAMs的數量和比例，因此M2型TAMs的數量和M2/M1 比值或許可成為結直腸癌肝轉移更準確的預測指標。

2.4 CRC中TAMs的促腫瘤作用機制

2.4.1 TAMs 促進腫瘤細胞增殖 體外實驗表明TAMs 分泌的炎性因子如CCL2、IL-1α、IL-6 和TNFα 以及極化后的M2 型TAMs 分泌的CCL17、CCL18、CXCL8、IL-10 和TGF-β 等細胞因子，可促進CRC 細胞增殖和腫瘤生長［19，22］。而通過體外共培養TAMs和C26 小鼠的結腸癌細胞后，發現TAMs 調節的氧化應激是影響結腸癌細胞增殖的主要機制，TAMs 可通過調節NADPH 氧化酶的活性維持ROS水平，從而維持TME的氧化還原狀態，促進腫瘤細胞增殖［34］。

2.4.2 TAMs 促進腫瘤血管生成 Marech 等［35］報道CRC 組織中TAMs 浸潤數量的增加伴隨腫瘤新生血管床的增加，體外實驗也證實TAMs分泌的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），在促進CRC腫瘤血管生成方面發揮重要作用［36］。而通過調節NADPH 氧化酶的活性，TAMs 可增強TME中血管生成蛋白的表達，從而維持腫瘤血管生成能力［34］。上述研究均表明TAMs 在CRC 血管生成中發揮重要作用。

2.4.3 TAMs促進腫瘤侵襲和轉移 細胞外基質（ex?tracellular matrix，ECM）重塑和上皮間質轉化（epithe?lial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤細胞獲得侵襲和轉移能力的重要影響因素。體外實驗證實，M2型TAMs 可產生的高水平的MMP，尤其是MMP-9 可促進ECM 降解，使結腸癌細胞的侵襲性增加，而且TAMs 可通過調節EMT 相關蛋白如E-cadherin、vi?mentin、β-catenin 和snail的表達，誘導CRC細胞發生EMT，使其侵襲和轉移能力增強［36-37］。此外，TAMs可通過KCNN4 通路上調p-GSK-3β（glycogen synthase kinase-3 beta）的表達，分泌IL-6和IL-8等細胞因子，從而促進CRC細胞侵襲和轉移［20］。

2.4.4 TAMs 參與5-FU 化療耐藥 TAMs 分泌的細胞因子是影響5-FU 化療耐藥的重要因素。體外實驗證實，M2型TAMs 分泌的CCL22，通過激活CCL22/PI3K/AKT 信號通路，減少5-FU 誘導的腫瘤細胞凋亡，從而使CRC 細胞對5-FU 耐藥［37］。而且TAMs 中的miR-155-5-p下調后可增加C/EBPβ的表達，促使IL-6轉錄增強，TAMs分泌的IL-6可通過激活CRC細胞中的IL-6R/STAT3/miR-204-5p 信號通路，減少藥物誘導的腫瘤細胞凋亡［29］。此外，TAMs 在5-FU 治療期間可分泌依賴鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarbox?ylase，ODC）產生的腐胺，腐胺通過減弱JNK-caspase-3 通路介導的細胞凋亡使CRC 細胞對5-FU 耐藥［38］。上述研究均提示TAMs是參與5-FU化療耐藥的重要因素，TAMs 或許可成為增強CRC 患者5-FU 化療敏感性的潛在靶點。

2.5 CRC中TAMs的抗腫瘤作用機制

有研究報道，TAMs的浸潤有利于CRC患者的預后，但多數研究僅分析了TAMs與CRC患者預后之間的關系，并未闡述TAMs 的抗腫瘤機制。目前，報道的CRC 中TAMs 的抗腫瘤作用主要包括促進抗腫瘤免疫應答、TAMs 的代謝調節和促進腫瘤細胞凋亡三個方面，具體如下。

2.5.1 TAMs 促進抗腫瘤免疫應答 有體外實驗證實，TAMs可分泌如CCL2、CCL7、CCL8和CXCL9等趨化因子將T 細胞招募到腫瘤部位，并表達CD74、CD40、CD80 和CD86 等表面分子為T 細胞提呈抗原并提供共刺激信號激活T細胞，從而發揮抗腫瘤免疫作用［39］。

2.5.2 TAMs 的代謝調節 ABHD5 作為脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）的輔激活劑，通過催化細胞內甘油三酯的水解參與其分解代謝［40］。有研究揭示了TAMs 的甘油三酯代謝與腫瘤轉移的關系，TAMs 中的ABHD5 通過抑制依賴NFκB（nuclear factor-κB）信號通路產生的MMP，從而減弱CRC 細胞的侵襲和轉移能力，這提示TAMs 中的ABHD5或許可作為CRC治療的靶點［41］。

2.5.3 TAMs 促進腫瘤細胞凋亡 有體外實驗證實，M1 型TAMs 條件培養基處理的CRC 細胞中，抗凋亡標志物SURVIVIN和BMI-1的表達水平降低，而凋亡標志物P21表達增加，隨后的蛋白免疫印跡實驗結果也證實凋亡相關的caspase 通路的激活增加，因此M1 型TAMs 可通過誘導腫瘤細胞凋亡，發揮其抗腫瘤作用［42］。

2.6 CRC細胞與TAMs的相互作用

CRC 微環境中免疫細胞和腫瘤細胞通過細胞因子的相互作用在腫瘤進展中發揮重要作用。TAMs分泌的IL-6 與腫瘤細胞表面的IL-6 受體結合后，通過調節JAK2/STAT3/miR-506-3p/FoxQ1軸，誘導CRC細胞的EMT，促進腫瘤細胞侵襲和轉移，而CRC細胞產生的CCL2進一步募集巨噬細胞到TME［17］。此外，腫瘤細胞分泌的組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）與TAMs細胞膜的TLR4結合后，通過mTOR依賴途徑刺激TAMs 極化為M2 型，極化后的TAMs 分泌的IL-10和IL-17 等細胞因子可通過NF-κB 信號通路促進CRC細胞的侵襲和轉移［43］。

另外，CRC細胞與TAMs之間也可以通過外泌體相互作用。外泌體是一種由細胞分泌的小膜泡（直徑30～150 nm），通過轉移蛋白質、DNA 和RNA 等內容物成為腫瘤細胞和間質細胞之間通訊的重要介質，TAMs來源的外泌體內的miR-21-5p和miR-155-5p 轉移到CRC 細胞后，與BRG1 編碼序列結合下調BRG1 的表達，從而促進CRC 細胞的遷移和侵襲［30］。而CRC 細胞通過激活CXCL12/CXCR4 軸上調miR-25-3p、miR-130b-3p、miR-425-5p的表達，這些外泌體miRNA 作用于TAMs 后，通過PTEN/PI3K/Akt 信號通路促使TAMs 極化為M2 表型，M2 型TAMs 進一步通過促進CRC細胞EMT和分泌VEGF，促進腫瘤細胞侵襲和轉移［44］。

3 TAMs與CRC的治療

3.1 TAMs作為免疫治療的靶點

免疫治療逐漸成為癌癥治療策略的一部分，CRC中免疫治療的方法主要包括T細胞療法、免疫檢查點抑制劑和基于DC的癌癥疫苗等［9］。其中免疫檢查點抑制劑，如PD-1及PD-L1抗體，主要的作用機制是阻斷T細胞與腫瘤細胞或抗原提呈細胞上相應的配體如PD-1/PDL1結合產生的免疫抑制從而發揮作用［45］。

Gordon 等［46］報道小鼠和人類TAMs 均表達高水平的PD-1，PD-1陽性的TAMs大部分為M2型且隨疾病的進展在TME 中增加，進一步的體內實驗表明，PD-1 的表達與TAMs 的吞噬能力呈負相關，而通過體內阻斷PD-1或PD-L1可增加TAMs的吞噬作用并抑制腫瘤生長，從而延長小鼠的生存期。另一項研究表明，高度微衛星不穩定（high microsatellite insta?bility，MSI-H）的CRC 患者中，PD-L1 的表達主要集中在腫瘤侵襲性前緣的M2 型TAMs 上，且伴隨腫瘤分化不良、淋巴浸潤和腫瘤出芽等［47］。因此，PD-1和PD-L1免疫檢查點抑制劑對M2型TAMs占主導地位的CRC患者的治療作用值得深入研究。

3.2 抑制TAMs的招募和活化

NT157 是一類新型的抗腫瘤藥物，主要靶向IGF-1R-IRS 和JAK-STAT 兩種致癌信號通路，對腫瘤細胞和TME 的關鍵成分均有抑制作用，研究表明NT157 可通過抑制CCL2、CCL5、IL-6、IL-11 和IL-10等細胞因子的表達，從而抑制TME中TAMs的招募和激活［48］。

3.3 重新誘導TAMs的表型極化

在CRC 患者衍生的功能性體外器官培養模型中，抑制CCR5 可通過調節TAMs 中的STAT3/SOCS3信號通路，使TAMs 從M2 向M1 表型復極化，從而發揮抗腫瘤作用，這些抗腫瘤作用隨后也在CCR5拮抗劑用于晚期難治性CRC肝轉移患者的Ⅰ期臨床試驗中得到證實［49］。

4 結語

綜上所述，目前CRC免疫治療中TAMs的應用仍面臨諸多問題，如TAMs 在CRC 中的作用尚存爭議，這可能與部分研究涉及的CRC 患者樣本量小、未明確TAMs 的功能亞型和定位以及不同類型的CRC 分子生物學差異等因素有關；以免疫檢查點為治療方向的免疫治療，目前主要集中于如何提高適應性免疫細胞如T 細胞的功能，關于以TAMs 為免疫治療靶點的基礎研究和臨床試驗研究較少。但是，近期研究表明，TME 中的TAMs 可表達PD-1、PD-L1 和髓源性特異免疫檢查點SIRPα（signal regulatory proteinα）［50］。因此，以TAMs為靶點的免疫治療或許可補充或協同增強免疫檢查點抑制劑如抗PD-1、PD-L1 和CTLA-4抗體的免疫治療的療效，從而使更多的CRC患者從免疫治療中獲益。與此同時，繼續深入研究TAMs在不同類型CRC TME中的作用機制，有助于準確調控TAMs使其發揮抗腫瘤作用。