不同運動強度對去勢大鼠骨質疏松軟骨形態的影響

文武 侯鐵奇

1.宜春學院體育學院，江西 宜春 336000 2.中山大學附屬第三醫院，廣東 廣州 510630

骨質疏松癥是基于每單位體積內骨量低于人體正常值、骨骼強度下降及脆性增加為主要臨床特點[1]。臨床表現為骨有機成分生成不足，從而引起骨組織結構發生變化，且多發生在絕經后女性及老年人群中。文獻報道顯示[2]，40歲以上人群中男、女骨質疏松及骨量減少癥比例上存在明顯差異，且骨質疏松癥女性發生率為19.9%，男性發生率為11.5%。而60歲以上人群骨質疏松癥發生率為28.6%，男性為15.0%，嚴重影響患者健康。由此看出，隨著我國居民年齡的增加，女性骨質疏松癥及骨量減少發生率均有所提高，可能與女性卵巢功能減弱、衰退及雌激素水平減少有關，引起體內骨量丟失，增加疾病發生率[3]。研究表明[4]，適當的運動有助于骨質疏松癥狀改善，能鍛煉能維持正常的關節軟骨形態結構及生理功能，但是臨床上對于運動強度缺乏報道。國外學者研究顯示[5]，女性在絕經早期肌力下降容易引起骨量下降，容易增加骨質疏松癥狀。患者如果在絕經早期進行運動鍛煉，能有效降低骨量丟失，提高骨密度，從而降低骨質疏松發生率[6]。

1 材料和方法

1.1 材料

取SD大鼠40只，12周齡，雌性，體重290～340 g，平均(318±16)kg，所選動物均由中山大學附屬第三醫院動物實驗中心提供。實驗過程中對SD大鼠飼養、處理均符合《關于善待實驗動物的指導下意見》[7]相關規則，動物質量合格證號SCXK2004-0006-152。所有試驗均通過醫院動物委員會批準同意。40只SD大鼠根據處理方法不同分為模型對照組、低強度組、中等強度組及高強度組，每組10只。取同期實驗的SD健康大鼠10只，作為假體手術組。

1.2 方法

去勢SD大鼠骨質疏松模型建立：空白組大鼠不采取任何措施處理，其余SD大鼠進行7 d適應性飼養后，采用10.0%水合氯醛根據體重0.3 mL/100 g腹腔內注射麻醉，大鼠背部1/3部位剪毛，采用碘酒進行局部皮膚消毒，沿著背部腰椎正中向下作長為2～3 cm切口，將皮膚牽向一側，切開筋膜，進入腹膜后在子宮角上采用線完成輸卵管結扎，切斷輸卵管，將卵巢提起，利用絲線結扎周圍相連組織，將大鼠卵巢切除，縫合腹膜切口，采用同樣的方法完成對側輸卵管切斷及卵巢切除，縫合皮膚切口，見圖1。

圖1 去勢SD大鼠骨質疏松模型建立 A：卵巢摘除手術；B：摘除雙側卵巢。Fig.1 Establishment of osteoporosis model by ovariectomized SD rats. A: Ovariectomy; B: Removal of bilateral ovaries.

大鼠造模前一周采用雙能 X 線骨密度儀完成大鼠骨密度的測定，大鼠在測試臺上采用小動物分析軟件測定大鼠的骨密度，得到未處理前的骨密度，大鼠生長3個月后采用濃度為5%按照體重為7 mL/kg水合氯醛經腹腔麻醉后采用相同的方法完成大鼠密度測定。本課題中，SD大鼠模型建立前骨密度為(0.201 1±0.012 6)g/cm2，模型建立后骨密度為(0.192 4±0.031 5)g/cm2，建模前后骨密度比較差異有統計學意義(P<0.05)，提示建模成功。

去勢SD大鼠骨質疏松模型處理方法：①運動前準備。術后1周后開始運動，為了讓大鼠適應跑臺，在正式實驗開始前1周，讓大鼠每天在跑步機中慢速跑步，速度10～15 m/min，每天跑步30 min，正式實驗后4組大鼠均進行相應的鍛煉。②運動方法。模型對照組不進行運動，常規飼養。造模成功后1周開始進行訓練，低強度組進行10 m/min跑臺訓練，中等強度組進行20 m/min跑臺訓練，高強度組進行25 m/min的跑臺訓練，每天1 h，連續訓練6周[8]。

標本的收集及保存：4組大鼠跑步完成3個月后采用脊椎脫臼法處死大鼠，取大鼠雙側后腿，鈍性分離關節周圍組織，充分暴露大鼠膝關節，并將雙側關節放入濃度為4%的多聚甲醛溶液中保存、待用[9]。

1.3 主要觀察指標

(1)關節軟骨mankin score評分及關節軟骨厚度。①MMS評分。參考Modified Mankin’s(MMS)評分標準對4組SD大鼠訓練6周結束后關節軟骨進行評定，評定內容包括結構、細胞、潮線、血管翳形成等，得分越低，治療效果越理想。②軟骨厚度。采用顯微鏡對關節軟骨厚度進行測量，從最厚處到最薄處[10]。(2)血清鈣、磷及MMP-3水平。采用甲基百里香酚藍比色法測定4組大鼠訓練6周結束后血清鈣離子水平；采用孔雀綠顯色法檢測4組血清磷水平；采用酶聯免疫吸附試驗檢測MMP-3水平[11]。(3)番紅O染色。訓練6周結束后收集大鼠標本，制備4 μm切片，染色前采用二甲苯進行固定，常規番紅O染色，倒置顯微鏡下觀察缺損部位情況[12]。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 4組SD大鼠MMS評分及關節軟骨厚度比較

中等強度組MMS評分低于低強度組、高強度組及模型對照組(P<0.05)，低強度組MMS評分低于高強度組及模型組(P<0.05)，高強度組MMS評分高于模型對照組(P<0.05)；中等強度組關節軟骨厚度高于低強度組、高強度組及模型對照組(P<0.05)，低強度組關節軟骨厚度高于高強度組及模型對照組(P<0.05)，高強度組關節軟骨厚度低于模型對照組(P<0.05)，見表1。

表1 4組SD大鼠MMS評分及關節軟骨厚度比較

2.2 4組SD大鼠血清鈣、磷及MMP-3水平比較

中等強度組血清鈣、血清磷水平低于低強度組、高強度組及模型對照組(P<0.05)，低強度組及高強度組血清鈣、血清磷水平低于高強度組及模型對照組(P<0.05)，低強度組血清鈣、血清磷水平低于高強度組(P<0.05)；低強度組與中等強度組MMP-3水平差異無統計學意義(P>0.05)，低于模型對照組(P<0.05)；高強度組MMP-3水平高于低強度組、中等強度組及模型對照組(P<0.05)，見表2。

表2 4組SD大鼠血清鈣、磷及MMP-3水平比較

2.3 4組SD大鼠番紅O染色比較

番紅O染色結果顯示，模型對照組軟骨表面光滑，呈圓形或橢圓形；低強度組大鼠人軟骨表面相對光滑，細胞數量相對較多，排列規則，染色加深；中載荷運動組軟骨表面光滑，染色明顯增粗，基質染色較深，染色均勻；高強度組潮線不規則，染色相對較淺，見圖2。

圖2 4組SD大鼠番紅O染色比較(×400)Fig.2 Comparison of safranine O staining among 4 groups of SD rats(×400)

3 討論

文獻報道顯示[13]，運動能促進軟骨細胞合成，在細胞外基質平衡中發揮了重要作用，但是該結論尚未得到進一步證實。為了進一步證實不同運動強度在骨質疏松中的作用及對軟骨形態的影響，課題中采用切斷輸卵管切除卵巢方法建立去勢大鼠骨質疏松模型，并且對大鼠進行不同強度的運動鍛煉。本研究中，中等強度組MMS評分低于低強度組、高強度組及模型對照組(P<0.05)；低強度組MMS評分低于高強度組及模型組(P<0.05)。提示中等強度運動能有效改善骨質疏松大鼠癥狀，改善機體軟骨形態。中等強度運動在力學刺激作用在軟骨后能提高軟骨細胞的生物合成活性，在力學作用下能引起軟骨的形態結構、成分等發生明顯的變化，使得軟骨形成一定的力學適應性。軟骨在正常生理狀態下具備一定的自我修復能力，該能力在軟骨損傷、修復中同時進行[14]。通過中等強度的運動鍛煉能讓關節軟骨承受較大的負荷，從而能改善關節軟骨的力學性能。文獻報道顯示[15]，中等強度運動能預防機體軟骨退變，能有效維持軟骨的正常形態，但是過量的運動或低強度運動容易加劇軟骨退行性變。

鈣、磷及MMP-3在骨質疏松的發生、發展中發揮了重要作用。本研究中，中等強度組血清鈣、血清磷水平低于低強度組、高強度組及模型對照組(P<0.05)，提示適宜載荷運動有助于骨形成，能促進骨骼的礦化，能降低大鼠血中鈣的濃度。MMP-3是軟骨中的膠原酶，對于II型膠原有高度的降解活性，中等強度運動下能降低MMP-3水平，而高強度作用下容易對關節軟骨產生負作用，能反映軟骨形態。本研究中，O番紅染色顯示模型對照組軟骨表面光滑，呈圓形或橢圓形；低強度組大鼠人軟骨表面相對光滑，細胞數量相對較多，排列規則，染色加深；中載荷運動組軟骨表面光滑，染色明顯增粗，基質染色較深，染色均勻；高強度組潮線不規則，染色相對較淺。由此看出，運動能造成軟骨產生適應性改變，使得軟骨厚度得到進一步增加，從而能提高軟骨的損傷閾值，有助于軟骨健康，提示不同強度運動對于大鼠的軟骨形態不同。但是高強度運動不利于軟骨生存，過量的運動超過了力學負荷超出了關節軟骨的損傷閾值，從而打破了軟骨內的穩態，導致軟骨細胞代謝發生異常。因此，骨質疏松大鼠運動時必須把握好運動強度，具有雙向性，過量的運動容易增加軟骨損傷，中等強度運動效果最佳，能提高骨質疏松治療效果，促進軟骨增生。

綜上所述，不同運動強度在去勢大鼠骨質疏松中效果不盡相同，低強度運動下對膝關節軟骨影響較小，高運動強度下容易造成軟骨退行性改變，而中等強度運動能維持骨關節軟骨形態，在骨質疏松預防和治療中效果理想。