艾塞那肽通過p38MAPK通路對成骨細胞促增殖和抗凋亡的作用研究

陳澤群 朱文雄 江銘 謝荏棠 張海濱

東莞市人民醫院骨三科，廣東 東莞 523000

骨質疏松癥是以低骨量、骨組織退化以及微結構破壞為特征的一種疾病，在全球具有較高的發病率，現階段治療骨質疏松的藥物以作用于破骨細胞為主，而作用于成骨細胞促進骨形成的藥物較少[1-2]。肥胖與骨質疏松和糖尿病的發生有著相關性，近期研究[3]表明胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的減少與骨質疏松有關，艾塞那肽(exenatide)作為一種GLP-1受體激動劑可用于治療骨質疏松，但是關于其機制的研究不多[4]。P38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)參與成骨細胞凋亡的啟動、細胞周期的靜止，誘導成骨細胞凋亡[5]。本文將主要分析艾塞那肽通過激活p38MAPK通路對成骨細胞促增殖和抗凋亡的作用機制，為臨床更好地治療骨質疏松提供新的思路和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料：小鼠成骨細胞MC3T3-E1 Subclone 14購自ATCC(美國)；MEM培養基以及胎牛血清購自Gibco(美國)；艾塞那肽購自禮來(美國)；CCK-8試劑盒和凋亡試劑盒購自Dojindo(日本)；流式細胞儀購自BD公司(美國)；棕櫚酸鈉購自Sigma(美國)；P38MAPK、Cyclin D1、Caspase-3一抗體和二抗均來自Abcam公司(美國)；PVDF膜(Bio-Rad，美國)。

1.1.2細胞分組與培養：MC3T3-E1 Subclone 14細胞系在含有10%胎牛血清的MEM培養基中培養，培養條件為37 ℃，5%的CO2。實驗分為對照組、艾塞那肽組、棕櫚酸鈉組、棕櫚酸鈉組+艾塞那肽組。棕櫚酸鈉組培養液棕櫚酸鈉終濃度為500 μmol/ L，艾塞那肽組培養中艾塞那肽終濃度為100 nmol/ L。共同培養48 h。

1.2 方法

1.2.1檢測細胞活力：CCK-8法被應用于測定細胞活力。將細胞接種于96孔板，加入10 μL CCK-8試劑并在37 ℃，5%的CO2中培養4 h。使用酶標儀(ELX 800，Bio-Teck，USA)測量每個孔在450 nm處的吸光度(OD)。

1.2.2檢測細胞凋亡：流式細胞術用于檢測細胞凋亡情況，細胞洗滌、重懸后分別按照試劑盒說明書加入試劑，通過流式細胞術檢測凋亡率。

1.2.3Western blot檢測：使用Western Blot檢測細胞中P38MAPK、Cyclin D1、Caspase-3蛋白水平。在液氮的保護下裂解細胞，在12 000 r/min，4 ℃下離心15 min收集上清液，使用BCA方法確定蛋白質濃度。使用10%的SDS-PAGE凝膠用于電泳，電泳后使用PVDF膜轉膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h，后在4 ℃孵育過夜，加入二抗。使用GAPDH作為內參。

1.3 統計學處理

實驗數據均以平均值±標準偏差(SD)表示。統計分析使用SPSS 19軟件(SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA)。進行單因素方差分析(ANOVA)以評估實驗組之間的差異。P<0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 艾塞那肽對細胞活力的影響

艾塞那肽對正常細胞活力無顯著影響(P>0.05)，棕櫚酸鈉組的細胞活力顯著低于對照組(P<0.01)，艾塞那肽+棕櫚酸鈉組的細胞活力顯著高于棕櫚酸鈉組(P<0.01)，見表1。

表1 艾塞那肽對細胞活力的影響Table 1 Effects of exenatide on cell viability

2.2 艾塞那肽對細胞凋亡的影響

艾塞那肽對正常細胞凋亡無顯著影響(P>0.05)，棕櫚酸鈉組的細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01)，艾塞那肽+棕櫚酸鈉組的細胞凋亡率顯著低于棕櫚酸鈉組(P<0.01)，見表2和圖1。

表2 艾塞那肽對細胞凋亡的影響Table 2 Effects of exenatide on apoptosis

圖1 流式細胞術檢測48 h時各組細胞凋亡Fig.1 Flow cytometry was used to detect the apoptosis of each group at 48 h

2.3 艾塞那肽對P38MAPK、Cyclin D1、Caspase-3的影響

艾塞那肽對正常細胞中P38MAPK、Cyclin D1和Caspase-3蛋白水平無明顯影響(P>0.05)，棕櫚酸鈉組的P38MAPK和Caspase-3顯著高于對照組而Cyclin D1顯著低于對照組(P<0.01)，艾塞那肽+棕櫚酸鈉組的P38MAPK和Caspase-3顯著低于棕櫚酸鈉組而Cyclin D1顯著高于棕櫚酸鈉組(P<0.01)，見表3。

表3 艾塞那肽對P38MAPK、Cyclin D1、Caspase-3的影響

3 討論

糖尿病患者患有骨折和骨質疏松癥的風險高，骨質疏松癥最近被認為是一種高脂性的疾病，研究[6]發現骨丟失通常伴隨著上調脂肪形成，糖尿病、肥胖和骨質疏松具有密切的關系。GLP-1腸降血糖素激素主要由腸內L-細胞和一些腦神經元中的胰高血糖素原基因編碼，在集體中GLP-1會被酶二肽基肽酶-4(DPP-4)快速降解。GLP-1在血糖控制和胰島細胞增殖中起著至關重要的作用，艾塞那肽已經是一種被廣泛使用的治療糖尿病的藥物，而近年來的研究發現艾塞那肽作為一種GLP-1激動劑，也具有調節脂肪形成和骨生成的作用[7]。

為分析艾塞那肽對骨質疏松的作用，本研究使用棕櫚酸鈉建立高脂模型，研究結果顯示棕櫚酸鈉可顯著的抑制成骨細胞的細胞活力，抑制細胞增殖，并促進細胞凋亡。而艾塞那肽可顯著恢復棕櫚酸鈉組的細胞活力，抑制成骨細胞的凋亡。國內最新研究[4]顯示艾塞那肽可以保護高脂環境下成骨細胞的生長并抑制凋亡。李軍等[8]的研究也發現GLP-1類似物利拉魯肽也可以保護高糖環境下的成骨細胞增殖和分化。國外也有研究[9]顯示GLP-1可抑制脂肪細胞分化并促進成骨細胞的生長和分化。這提示艾塞那肽可能通過促進成骨細胞增殖和抑制凋亡治療骨質疏松。

為進一步分析艾塞那肽對保護高脂環境下成骨細胞生長的機制，筆者分析了其對p38MAPK通路的影響。p38MAPK屬于MAPK亞類，可通過調節增殖、凋亡相關基因參與多種腫瘤的發生和發展，在不同細胞中p38MAPK的作用可能不同[10]。研究[11]顯示高糖可通過上調p38MAPK通路的表達誘導成骨細胞的凋亡，而抑制p38MAPK的磷酸化可保護成骨細胞，促進其增殖，抑制其凋亡。本次研究結果顯示艾塞那肽對正常細胞無明顯影響，棕櫚酸鈉組的P38MAPK和Caspase-3顯著高于對照組而Cyclin D1顯著低于對照組，艾塞那肽+棕櫚酸鈉組的P38MAPK和Caspase-3顯著低于棕櫚酸鈉組而Cyclin D1顯著高于棕櫚酸鈉組。Marie等[12]的研究顯示艾塞那肽可顯著提高小鼠的骨量。成骨細胞p38MAPK的過度磷酸化引起成骨細胞的凋亡[13]。黃超等[14]研究發現艾塞那肽會通過p38MAPK通路調節細胞的增殖和凋亡。過往有研究[15]發現GLP-1類似物可通過抑制p38MAPK通路減輕炎性損傷。曾海龍等[16]的研究也顯示GLP-1可以抑制p38MAPK通路抗凋亡。這說明艾塞那肽可以通過抑制p38MAPK通路提高高脂環境下成骨細胞活力，抑制凋亡。

綜上所述，艾塞那肽可以通過p38MAPK通路，減少Caspase-3蛋白并上調Cyclin D1蛋白的表達，抑制高脂環境下成骨細胞的凋亡并提高細胞活力。

這提示艾塞那肽可能對肥胖引起的骨質疏松具有一定的治療作用，但是關于艾塞那肽對成骨細胞的作用機制還需進一步展開研究。