雌二醇對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織Wnt/β-catenin信號通路的影響

邱敏 翟書珩 付勤

中國醫科大學附屬盛京醫院骨科，遼寧 沈陽 110004

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)是由于雌激素缺乏或水平下降，成骨細胞承擔的骨形成和破骨細胞承擔的骨吸收活動之間的平衡被打破，骨吸收超過了骨形成，從而引起骨量減少、骨組織顯微結構退化，進而導致骨脆性增高、骨強度降低、骨折危險性增加的一種全身代謝性骨骼疾病[1-2]。PMO過程涉及多種細胞因子信號通路的調控[3]。近年來發現經典Wnt/β-catenin信號通路在骨形成過程中發揮重要作用，已成為骨質疏松領域的研究熱點[4]。本研究通過觀察雌二醇對去卵巢骨質疏松癥大鼠Wnt/β-Catenin信號通路相關因子表達的影響，探討雌二醇防治PMO的相關分子生物學機制，為其在抗PMO的應用提供新思路和新依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

戊酸雌二醇片(補佳樂)購于拜耳醫藥保健有限公司(規格：1 mg/片，生產批號：20180083)，羊抗兔Wnt、β-catenin和BMP-2多克隆抗體購于美國R&D公司，β-actin多克隆抗體及兔抗鼠二抗體購于武漢博士德生物有限公司，Prime ScriptTM反轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司，PV-9000免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。DPX-L型雙能X線骨密度測定儀購于美國GE公司，MTS-858型電子萬能生物力學材料試驗機購于美國MA公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組：清潔SPF級雌性SD大鼠80只，4月齡，體重(360±30)g，由中國醫科大學醫學實驗動物中心提供，同等條件(溫度：20 ℃～25 ℃，濕度：60%～70%，12 h間隔正常照明，自由飲食攝水)分籠飼養。按隨機數字法分為對照組、假手術組，去勢組和藥物組。對照組常規飼養。

1.2.2骨質疏松大鼠造模及藥物干預：參照文獻[5]采用雙側卵巢切除術方法構建骨質疏松大鼠動物模型，假手術組僅切除卵巢周圍等量脂肪組織，去勢組和藥物組均行雙側卵巢切除術。造模成功后第3天給予各組藥物處理(參照大鼠體表面積比值計算)，藥物組按照1 mL/100 g體質量給予0.02 mg/mL戊酸雌二醇水溶液灌胃，對照組、假手術組和去勢組給予等量0.9% 氯化鈉灌胃)，1次/d，連續用藥8周。

1.2.3組織取材：藥物干預8周后，用2%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，采用快速心臟急性大失血法處死大鼠，逐層剝離雙側股骨，用0.9%氯化鈉濕紗布和錫箔紙包裹，-20 ℃保存備用待檢測。另留取部分股骨10%甲醛溶液固定，10%EDTA脫鈣6周，脫水透明，制成石蠟切片，保存備用待檢測。

1.2.4骨組織骨密度(BMD)測定：取出待測大鼠右股骨，室溫平衡30 min，通過LUNAR雙能X線吸收掃描儀掃測，采用掃描模式(掃描類型hHi-Res、掃描精度1%、掃描速度60 mm/s、掃描寬度5.0 cm、分辨率1.0 mm×1.0 mm)，用儀器選定全部股骨及股骨端上下區域，應用軟件分析計算BMD值。

1.2.5骨組織生物力學測定：取出右側股骨，室溫平衡30 min，游標卡尺測量股骨長度，置于MTS-858型電子萬能生物力學材料試驗機進行三點彎曲力學試驗，參考指標(支點跨距20 mm、最大量程1 000 N、加載速度2 mm/min)，計算機記錄儀記錄載荷-變形曲線，計算最大載荷、最大應力和剛度。

1.2.6實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的基因表達：取骨組織20 mg，液氮下充分研磨至粉末，參照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，計算RNA純度及濃度。按照反轉錄試劑盒說明書操作獲得cDNA，加入相應PCR反應體系(20 μL)，PCR熱循環儀擴增，擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火50 s，延伸30 s，40次循環擴增。實驗結果以正常組為參照組，采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴增引物序列Table 1 qRT-PCR amplification primer sequence

1.2.7HE染色觀察骨組織形態學：取出石蠟切片，脫蠟水化，流水沖洗，染色(蘇木精)10 min，流水沖洗，分化(鹽酸酒精)10 s，流水沖洗，返藍，蒸餾水洗滌3～5 s；染色(伊紅)2～3 min，流水沖洗；再次脫水、透明，封片，光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.2.8免疫組織化學染色法檢測股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表達：嚴格按照試劑盒說明書操作，PBS緩沖液作陰性對照，一抗稀釋倍數(1∶200)，光學顯微鏡觀察并采集圖片，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析，結果用平均光密度值(MOD)表示。

1.3 統計學分析

2 結果

圖1 各組大鼠股骨骨組織Wnt蛋白表達(×200)A：對照組；B：假手術組；C：去勢組；D：藥物組。Fig.1 The Wnt protein expression in femoral bone tissues of rats in each group (×200)

2.1 股骨骨組織BMD比較

對照組、假手術組股骨和上下端的BMD無顯著差異(P>0.05)，去勢組股骨和上下端的BMD較對照組、假手術組均顯著降低(P<0.05)，藥物組股骨和上下端的BMD較去勢組均顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠股骨骨組織BMD比較

2.2 股骨骨組織生物力學比較

對照組和假手術組股骨最大載荷、最大應力和剛度無顯著差異(P>0.05)，去勢組股骨最大載荷、最大應力和剛度較對照組和假手術組均顯著降低(P<0.05)，藥物組股骨最大載荷、最大應力和剛度較去勢組均顯著升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠股骨骨組織生物力學指標比較

2.3 股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA表達比較

對照組和假手術組骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA無顯著差異(P<0.05)，去勢組骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA較對照組和假手術組顯著降低(P<0.05)，藥物組骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA較去勢組顯著增高(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA相對表達量

2.4 股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表達比較

Wnt和β-catenin主要表達主要定位于成骨細胞胞膜和胞質，BMP-2主要表達定位于成骨細胞胞質，陽性反應胞質或胞膜呈黃色或棕黃色。對照組與假手術組股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)，去勢組股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表達水平較對照組和假手術組顯著降低(P<0.05)，藥物組股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表達水平較去勢組顯著升高(P<0.05)。見圖1～圖3、表5。

圖2 各組大鼠股骨骨組織β-catenin蛋白表達(×200)A：對照組；B：假手術組；C：去勢組；D：藥物組。Fig.2 The β-catenin protein expression of rat femoral bone tissues in each group (×200)

圖3 各組大鼠股骨骨組織BMP-2蛋白表達(×200)A：對照組；B：假手術組；C：去勢組；D：藥物組。Fig.3 The BMP-2 protein expression of rat femoral bone tissues in each group (×200)

表5 各組大鼠股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表達比較

2.5 股骨骨組織形態學比較

對照組和假手術組骨松質結構完整，骨小梁粗壯飽滿、均勻致密，排列規則，連接成網狀，骨髓腔較小，骨髓細胞數量豐富。去勢組呈骨質疏松特征性骨松質結構改變，骨小梁明顯減少，排列稀疏不規則，連接不完整，部分纖細或出現斷裂現象，骨髓腔變大，有大量纖維組織。藥物組骨松質骨小梁數量減少不明顯，粗細均勻稍致密，排列尚規則，連續完整性較好。見圖4。

圖4 HE染色觀察骨股骨股組織的形態結構(×200)A：對照組；B：假手術組；C：去勢組；D：藥物組。Fig.4 Observation of morphological structure of femoral tissue by HE staining (×200)

3 討論

隨著全球人口老齡化程度的不斷加劇，PMO發病率呈逐年上升趨勢，目前已成為全世界關注的健康問題之一。PMO多見于絕經后老年婦女，其并發癥常見且預后不良，給家庭和社會帶來了帶來沉重的負擔，我國已將其列為重點攻關的老年病之一[6]。對于PMO的防治研究目前已成為研究的熱點問題。

雌激素水平降低是PMO的主要原因，雌激素缺乏可導致成骨細胞和破骨細胞的比例失衡，骨形成基本正常，骨吸收增強，骨轉換加快，骨量丟失，引發PMO發生[7]。雌激素是目前臨床應用防治PMO的首選藥物，雌激素既可通過直接結合破骨細胞表面受體，抑制破骨細胞，延緩骨吸收，又可直接結合成骨細胞表面受體，調節成骨代謝等[8-9]。近年來，隨著對Wnt/β-catenin信號通路研究的深入，大量研究[10]表明雌激素可通過調控經典Wnt/β-catenin信號傳導通路，促進骨形成，抑制骨吸收。雌激素調控Wnt/β-catenin信號通路治療PMO逐漸成為此領域的研究熱點。

Wnt/β-catenin信號通路在骨形成和骨重建過程中起著關鍵性作用。細胞外Wnt因子與跨膜受體卷曲蛋白(Frz)和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)相結合，通過胞質內的蓬亂蛋白(Dv)和酪蛋白激酶-1α(CK1α)傳遞信號，活化由軸蛋白/結腸腺瘤性蛋白/糖原合成酶激酶3β(Axin/APC/GSK-3β)復合物，使β-catenin胞質內大量聚集并進入胞核內與T細胞轉錄因子/淋巴增強因子(LEF/TCF)結合形成復合聚體，激活下游基因Runx2、BMP-2、c-myc等靶基因的轉錄[11-12]。研究[13]表明雌激素可通過激活該信號通路途徑影響BMP-2活性或表達，誘導成骨細胞增殖和分化，增強成骨細胞礦化活性，抑制成骨細胞凋亡；同時調節和促進骨髓間充質干細胞(BMSC)分化為成骨細胞，增加骨強度，促進新骨形成[14]。因此Wnt信號通路被認為在成骨細胞的分化、增殖、遷移等調控方面發揮了重要作用。

本研究表明，雌二醇能顯著提高去勢骨質疏松大鼠股骨BMD、最大載荷、最大應力和剛度，促進骨組織Wnt、β-catenin、BMP-2的表達，改善PMO骨松質結構。表明Wnt/β-catenin信號傳導途徑對成骨細胞增殖分化起著關鍵性作用，PMO大鼠骨組織Wnt/β-catenin信號通路中重要分子表達量下降，而雌二醇能通過促進Wnt/β-catenin信號通路激活下游靶基因BMP-2，上調基因表達，促進成骨細胞的增殖分化，促進骨形成，抑制骨破壞，調節骨重建系統的平衡，提高骨密度和骨生物力學性能，改善骨組織形態結構，從而起到抗PMO作用。同樣黃佳等[15]通過細胞研究表明雌二醇可通過ERα/GSK-3β/β-catenin信號通路調節小鼠成骨細胞增殖。魏雙雙等[16]的研究表明雌激素可能通過上調Wnt16、β-catenin、OPG表達，下調RANKL表達，發揮對骨組織的保護作用，起到抗骨質疏松作用。

綜上所述，雌二醇能夠通過經典Wnt/β-catenin信號通路，激活BMP-2表達，促進去卵巢骨質疏松大鼠成骨細胞的增殖、分化，增加骨密度，提高骨生物力學性能，改善骨組織微觀結構，具有抗PMO的作用。然而雌激素抗PMO涉及多條信號通路，各通路之間交互作用，對單一信號通路的分析是遠遠不夠的，在后續研究中，筆者將對其他相關的信號通路進行探討。同時，對此類藥物的研究還涉及給藥方式、給藥劑量、藥物療程以及藥物安全性等諸多問題，還需進行更加深入的研究分析與全面評估。