M2型巨噬細胞與彌漫性大B細胞淋巴瘤預后的研究進展

李捷凱 周永明

彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是世界范圍內最常見的非霍奇金淋巴瘤類型，約占不同地理區域所有病例的30%～40%[1]。DLBCL患者的標準療法是利妥昔單抗、環磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松(R-CHOP)方案，使用該方案約60%～70%的DLBCL患者可以治愈，但仍有部分患者會復發，甚至存在少許患者對R-CHOP治療無效的現象。因此對于彌漫性大B細胞淋巴瘤患者預后及生存狀況等相關研究一直是抗腫瘤研究的重點之一。腫瘤相關的微環境在不同類型腫瘤的發生、發展中起著至關重要的作用，腫瘤相關巨噬細胞是腫瘤微環境中的主要成分，它與彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)患者的臨床狀況和生存狀況有關，巨噬細胞在體內主要分為M1型(主要表達CD68和HLA-DR)和M2型(同時表達CD68和CD163)，前者稱經典活化的巨噬細胞，起到抑制腫瘤生長的作用；而后者稱為腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)，則通過促進血管增生，協助腫瘤轉移和免疫抑制來促使腫瘤細胞的生長和耐藥性[2]。有研究發現即使在利妥昔單抗時代，M2型巨噬細胞數量增加也與DLBCL患者的預后密切相關[3]。本文就M2型巨噬細胞在細胞外基質、促進血管增生、影響免疫微環境等方面影響彌漫性大B細胞淋巴瘤預后的相關研究進展做一綜述。

一、重塑細胞外基質

1.Legumain：Legumain是一種天冬酰胺基內肽酶，屬于半胱氨酸蛋白酶C13家族中的一員[4]。越來越多的數據已經證明了豆莢蛋白在多種腫瘤類型中的表達，提示其在腫瘤進展中的作用，尤其是對細胞外基質有著調節作用。研究發現，TAMs表達大量的豆莢蛋白， 一種抗豆莢蛋白的疫苗或抑制劑可顯著消除TAMs，從而抑制鼠類腫瘤模型中的腫瘤生長和轉移[5]。Shen 等[6]在OCI-Ly3異種移植小鼠模型研究中通過對CD206與Legumain的共同標記證明了Legumain在DLBCL的腫瘤微環境中過表達，研究發現，因TAMs中Legumain過度表達，導致細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的主要成分纖維蛋白和膠原蛋白Ⅰ分解代謝，進而起到重塑細胞外基質的作用。此外Legumain的過度表達還會刺激血管再生，新血管形成是腫瘤進展期間的關鍵過程，而Legumain抑制劑的使用則可以限制腫瘤的擴展，ECM的重建與血管再生。隨著對Legumain作用機制的進一步研究，Legumain很有可能成為潛在預后指標，而給予Legumain抑制劑可能將成為一種優化DLBCL治療、改善患者預后的潛在方法。

2.基質金屬蛋白酶-9與可溶性白介素2受體：可溶性白細胞介素2受體(SIL-2R)是一種可溶性形式的IL-2R，較高的血清SIL-2R水平與某些形式的淋巴瘤的不良預后相關，例如成人T細胞白血病/淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤(FL)、外周血T細胞淋巴瘤和套細胞淋巴瘤[7]。Umino等[8]對97例處于復發或難治階段DLBCL患者的數據進行回顧性分析發現化療后6個月內疾病進展的復發或難治階段患者的SIL-2R(這個階段的可溶性白細胞介素2受體簡稱“r/r SIL-2R”)的最佳臨界值為861U/ml，高r/r SIL-2R組的生存率明顯低于低r/r SIL-2R組，在多變量分析中，r/r sIL-2R與較低的1年無事件生存率(EFS)和總體生存率(OS)之間存在獨立的顯著相關性。

基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)是MMP家族中的一員，具有裂解白介素2受體鏈的能力，它可以切斷IL-2R的α鏈使得SIL-2R的濃度增加。已有研究發現腫瘤微環境細胞的基因表達譜，TAMs的表型存在基質金屬蛋白酶(MMP)的過表達，DLBCL腫瘤組織中的MMP-9主要由TAMs產生并分泌[9]。MMP-9可以裂解許多細胞外基質(ECM)蛋白如Ⅰ型膠原纖維蛋白來調節ECM重塑，對腫瘤的侵襲、轉移產生正面影響，最終導致患者對治療的耐藥或疾病復發[10]。SIL-2R是T淋巴細胞淋巴瘤/白血病的常用檢測指標之一，該指標對于一些難治性或復發的DLBCL患者同樣可以起到預測作用。MMP-9與SIL-2R之間的關系及其對細胞外基質的重塑可以為新一代的靶向藥物提供方向，希望通過進一步研究能研發出干擾MMP-9合成與分泌的新藥來改善患者的預后。

二、新血管增生

2.微血管密度：細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是多細胞有機體中細胞周圍由多種大分子組成的復雜網絡，主要由5類物質組成，即膠原蛋白、非膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖及氨基聚糖，通過信號轉導系統影響細胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖、分化。因此對腫瘤的發生、發展和轉移起到重要作用[12]。根據細胞外基質基因表達譜的不同可將其分為1型與2型基質，前者主要反映了細胞基質沉積和組織細胞浸潤，后者主要反映了微血管密度(microvessel density，MVD)和血管生成[13]。Shahini 等[14]觀察到彌漫性大B細胞2型基質表達相對高的淋巴瘤與腫瘤血管密度增加和不良預后相關，并發現不論患者是接受伴有利妥昔單抗的標準治療還是CHOP治療，2型基質基因高表達的患者存在預后較差現象。吳金錕等[15]通過研究M2型巨噬細胞表達的CD68與微血管密度之間的關系發現CD68與微血管密度高表達呈正相關。TAMs可以通過提高VEGF水平促進血管內皮細胞生長，來增加腫瘤微環境的微血管密度，改善腫瘤組織的供血供氧情況，進而導致DLBCL腫瘤細胞的轉移與浸潤。

三、影響免疫微環境

1.程序性細胞死亡受體1/程序性細胞死亡配體1信號通路：程序性細胞死亡配體1(PD-L1)，是B7受體家族的成員，是一種在T細胞表面表達的抑制性受體，與其同源受體PD-1結合后會轉導抑制信號，從而抑制周圍組織活化T細胞的增殖，抑制宿主抗腫瘤反應，進而為腫瘤創造一個免疫抑制的環境，最終導致腫瘤進展和患者預后不良。Kiyasu 等[16]通過對DLBCL活檢樣本進行PD-L1/PAX5雙重免疫染色并研究發現PD-1和PD-L1陽性的患者與患者的生存率顯著相關，多變量分析表明PD-1表達是OS的預后獨立因素，PD-L1表達與DLBCL患者較差的臨床預后相關(P=0.049)。此外，與PD-L1(-)DLBCL患者比較，PD-L1(+)DLBCL患者的總生存期較差。

通過對CD68與PD-L1進行標記，有研究者發現在彌漫性大B細胞淋巴瘤組織中，主要是TAMs在表達PD-L1，同時也有少量腫瘤細胞在表達PD-L1[17]。因此，PD-1/PD-L1途徑也可能促進DLBCL腫瘤細胞的增殖，這也許是治療DLBCL患者的一種新思路。TAMs與腫瘤細胞通過共同表達PD-L1，為腫瘤提供了免疫抑制的微環境，抑制免疫監視，促使瘤細胞的逃逸，影響患者預后。目前已有抗PD-1單抗靶向藥物Nivolumab的問世，在復發/難治性經典霍奇金淋巴瘤的治療中取得顯著的臨床療效[2]。相信通過進一步研究及更多臨床試驗后，抗PD-1/PD-L1的藥物也能應用到復發/難治性彌漫性大B細胞淋巴瘤患者身上，改善預后與生存狀況。

2.人白細胞抗原-DR：人白細胞抗原(HLA)-DR是Ⅱ類主要組織相容性復合體(MHC)蛋白之一，與抗原遞呈有關，可以幫助宿主免疫系統識別和攻擊腫瘤細胞。因此，腫瘤細胞表面喪失HLA-DR的表達削弱宿主免疫系統對瘤細胞的識別與攻擊，營造一個免疫抑制微環境，使這些腫瘤細胞可以存活。據報道，有研究者發現HLA-DR表達喪失與DLBCL患者的預后不良相關。Higashi 等[18]為了進一步評估HLA-DR表達缺失對DLBCL患者生存的影響，通過多變量回歸分析發現HLA-DR表達的喪失是生存的獨立預后因素。此外他們還通過HLA-DR在淋巴瘤中的免疫組織化學表達發現DLBCL中HLA-DR表達的喪失降低了腫瘤微環境中輔助T細胞的比例，這可能有助于腫瘤細胞逃避免疫監視。TAMs與HLA-DR之間是存在一定關系的，TAMs會下調MHC Ⅱ類表達，進而影響到HLA-DR的表達。以上研究表明TAMs可能通過下調MHC Ⅱ類蛋白的表達促使腫瘤細胞免疫逃逸，相反腫瘤細胞上HLA-DR的高表達會抑制巨噬細胞介導的腫瘤發展。故而可以推測通過免疫靶向TAMs可能有益于HLA-DR表達異常的患者。

3.白細胞介素-27/STAT3信號通路：白細胞介素27(interleukin-27，IL-27)是異二聚體細胞因子家族的成員，在促炎與抗炎相關的免疫應答中起到多重作用，盡管小鼠實驗的諸多證據表明IL-27具有有效的抗腫瘤活性，但它就像一把雙刃劍,增加IL-10的產生及程序性死亡配體1的表達、也有增強腫瘤生長轉移的作用。Horlad 等[19]研究發現淋巴瘤病理組織中，IL-27通過STAT3激活誘導巨噬細胞上PD-L1的表達進而抑制機體免疫能力。因此，通過IL-27異二聚體腫瘤細胞及M2型巨噬細胞能夠共同創造一個免疫抑制微環境，促進DLBCL的進展。盡管IL-27既有抗腫瘤作用又有促進腫瘤生長的作用，但這預示著IL-27在DLBCL中的作用機制尚需進一步研究，白細胞介素27/STAT3信號通路對DLBCL患者預后治療研究也十分重要，可能是淋巴瘤患者免疫治療的靶標。

四、其他影響方面

1. CAR T細胞治療：專門針對CAR T細胞在治療各種血液系統惡性腫瘤(尤其是B-NHL)方面顯示出明顯的功效。 Yan 等[20]研究發現，巨噬細胞的數量與極化狀態有助于免疫抑制微環境的出現和T細胞反應的抑制。同時，巨噬細胞可能會產生不利的微環境，減輕CAR T細胞反應，因此，影響巨噬細胞的極化與數量可以改善B-NHL患者的CAR T細胞治療的臨床療效，改善患者預后。腫瘤微環境的組成對CAR T細胞治療的臨床療效密切相關。相信通過靶向TAM及其他免疫抑制因子并進行干預來調節腫瘤微環境可能具有使CAR T細胞治療更持久、療效更好的潛力。

2.絕對單核細胞計數及炎性細胞因子：即使在利妥昔單抗的時代，TAM表面高表達CD68或CD163的患者的總生存期(OS)和無進展生存期(PFS)也分別比CD68或CD163低表達的患者差。此外，Li 等[21]研究發現，TAM與外周絕對單核細胞計數之間呈正相關，由此推論單核細胞從外周血被募集到腫瘤微環境后分化成巨噬細胞，通過極化成為M2型巨噬細胞，從而導致疾病進展。單核細胞及其后代促進腫瘤生長和血管生成，并參與抑制宿主抗腫瘤免疫。越來越多的研究發現，在許多實體瘤中包括DLBCL，外周單核細胞升高是不利的預后因素。之前便有報道，接受標準R-CHOP治療的DLBCL患者的外周絕對單核細胞計數在診斷時可預測患者的預后，首次復發時絕對單核細胞計數升高是復發性或難治性DLBCL患者生存的不良預后因素，而且標準R-CHOP治療后隨訪期間進行的絕對單核細胞計數升高是預測DLBCL復發的危險因素。除了絕對單核細胞計數，有研究者發現細胞因子可以調節巨噬細胞向M2表型轉化進而調節腸道炎癥，還可通過測定外周血炎性細胞因子的濃度來預測DLBCL患者的生存。研究者通過篩選表達與DLBCL患者存活率相關的炎性基因，以此建立了獨立于IPI評分的預測模型。因此，即使在IPI低評分組也可以識別出高危人群的5年生存率。

3.miR-155：miR-155是一種microRNA，是致癌開始時誘導M1巨噬細胞，募集炎性細胞和抗腫瘤反應所必需的，通常在B細胞淋巴增生性疾病中過表達。EB病毒感染是第一個檢測到microRNA表達的病毒，EB病毒感染也可能有助于改變B細胞淋巴瘤中的microRNA水平[2]。EB病毒通過誘導感染的B細胞分泌免疫抑制細胞因子如IL-10和TGF-β，直接影響巨噬細胞向M2型極化。研究者在研究中對50歲以上且無免疫抑制的彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)患者中的巨噬細胞浸潤和miR-155表達進行比較，發現未感染EB病毒的DLBCL中，miR-155的過表達與M2型巨噬細胞極化降低有關，在感染EB病毒的DLBCL中情況則相反。Zonari 報道巨噬細胞中miR-155的不足會導致M1型巨噬細胞極化受損，而分化為M2型巨噬細胞。通過以上研究可以知曉，調節miR-155的表達或預防和重新編程免疫調節和巨噬細胞極化的治療策略可以輔助標準治療，這可能是治療EBV+DLBCL的新方法。

4.細胞外囊泡：幾乎所有細胞都分泌細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，它們包含蛋白質、脂質和核酸，充當細胞間通信和分子轉移的介質。 在腫瘤中，EVs來自癌細胞，免疫細胞以及其他非免疫宿主細胞，是腫瘤微環境的關鍵組成部分。不同來源的EVs在腫瘤免疫中起著不同的作用，影響著腫瘤的增殖、轉移及其對治療的耐藥性。研究發現，DLBCL衍生的EVs可以通過增加PGC-1β蛋白的表達來調節氧化代謝，促進抗炎活化的巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化來調節腫瘤微環境，從而加速腫瘤的進展。可想而知，早期對PGC-1β蛋白進行檢測對篩選出預后不良的DLBCL患者是有幫助的。而且針對細胞外囊泡或PGC-1β進行靶向治療也許是將成為治療DLBCL的新思路。

五、展 望

彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤，是一種高度異質且有侵襲性疾病。當前的標準療法是R-CHOP治療，盡管在利妥昔單抗的時代，DLBCL逐漸成為一種可治愈性疾病，但仍有部分患者存在復發、耐藥的情況，導致最終預后不良。研究者通過基因檢測發現DLBCL患者的生存不僅與腫瘤本身相關，與腫瘤微環境同樣密不可分。巨噬細胞是微環境中重要的免疫細胞，通過表達Legumain蛋白、分泌MMP-9并影響SIL-2R濃度重塑細胞外基質；通過分泌高水平血管內皮生長因子影響微血管密度并促進血管再生、通過PD-1/PD-L1信號通路與HLA-DR影響免疫微環境、協助免疫逃逸等方面影響著DLBCL的發生、發展、轉移及患者的預后。

綜上所述，通過了解TAMs與DLBCL患者預后之間的聯系及對相關機制的研究，可以為判斷患者的預后及治療找到新思路新方法，探索更便捷更有指向性的預后指標和新的治療靶點，為臨床試驗提供堅實理論基礎。希望可以通過不斷發現的新機制以及對TAMs的表型研究、精準標記TAMs方面做深入研究，不但能協助早期識別易復發或難治的患者并提供針對性治療，還能研發新靶向藥物，為DLBCL患者帶來福音。