健脾益氣攝血顆粒對斑馬魚腸道出血模型的止血作用評價

王 珺 王 博 張 蘊 周郁鴻 徐懿喬 張 勇 陳信義

HemostaticEffectofJianpiyiqiShexueGranulesonZebrafishIntestinalHemorrhageMode.WangJun,WangBo,ZhangYun,etal.TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity(ZhejiangProvincialHospitalofTCM),Zhejiang310006,China

AbstractObjectiveTo establish a model of thrombocytopenia in zebrafish complicated with intestinal bleeding, and to observe the hemostatic effect of jianpi yiqi granules on intestinal bleeding in zebrafish, so as to provide a basis for clinical promotion and application.MethodsAfter measuring the maximum lethal drug concentration, simvastatin was used to induce a zebrafish intestinal hemorrhage model, and the three different doses of jianpi yiqi granules 56, 167 and 500μg/ml were determined as the intervention drugs. The hemostatic effect of jianpi yiqi granules on the intestinal hemorrhage of zebrafish was evaluated with the incidence of zebrafish intestinal hemorrhage, which also can reduce the intestinal bleeding and the hemostatic rate.ResultsThe zebrafish intestinal hemorrhage rate in the model control group was 70%. After intervention with Jianpiyiqi blood-taking particles 56, 167 and 500μg/ml, the zebrafish intestinal bleeding rates were 37%, 40% and 80%, respectively. Among them, the two dose groups of 56μg/ml and 167μg/ml were statistically significant compared with the model control group (P<0.05). The results showed that the concentration of small dose of jianpi yiqi granules could significantly reduce the incidence of intestinal bleeding in zebrafish. The number of platelets in the intestinal tract of zebrafish in the model control group was 16.60, and the number of platelets in the intestinal tract of zebrafish was 7.60, 8.00 and 15.50 respectively, after the intervention with concentrations of 56, 167 and 500μg/ml, which was statistically significant compared with the model control group (P<0.01, 0.01 and 0.05). Intestinal hemostasis was 54%, 52% and 7%, respectively. The results showed that small dose of jianpi yiqi granules had obvious hemostatic effect on intestinal bleeding of zebrafish.ConclusionSmall dose (56μg/ml) and medium dose (167μg/ml) of jianpi yiqi granules can not only significantly reduce the intestinal bleeding rate of zebrafish, but also have good hemostatic effect.

KeywordsImmune thrombocytopenia; Jianpi yiqi granules； Zebrafish intestinal bleeding

ITP是臨床最常見的出血性疾病，多數(shù)病例可見多部位出血，如皮膚瘀斑、瘀點或黏膜出血，嚴重者可見內(nèi)臟出血，如尿血、便血等[1]。基于審證求因與辨證施治理論，急性ITP多見熱邪導(dǎo)致的“熱迫血行”證候，宜“清熱解毒涼血止血”治療[2]；慢性ITP多由脾氣虛弱導(dǎo)致“氣不攝血”證候，宜“健脾益氣攝血”治療[3]。課題組在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，具有“健脾益氣攝血”功效的健脾益氣攝血顆粒能夠明顯改善ITP患者臨床癥狀，提升外周血小板計數(shù)，并有較好的止血效果[4]。基礎(chǔ)研究也證實，健脾益氣攝血顆粒可以明顯降低出血模型斑馬魚腦、肝臟、心臟出血發(fā)生率[5，6]。本研究采用辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚腸道出血模型，并對健脾益氣攝血顆粒止血效果進行了評價。

材料與方法

1.實驗動物：野生型AB品系斑馬魚以自然成對交配繁殖方式進行，年齡為受精后2天(2dpf)和4天(4dpf)，用于腸道出血模型建立與腸道出血效果評價。血小板熒光斑馬魚Tg(-6.0itga2b:EGFP)購自國家斑馬魚資源中心，以自然成對交配繁殖方式進行，年齡為4dpf，主要用于腸道止血作用評價。實驗完成后用三卡因甲磺酸對各個發(fā)育階段的斑馬魚進行過度暴露處理，從而將斑馬魚麻醉處死。斑馬魚設(shè)備和實驗符合AAALAC要求(IACUC許可證號：001458)。

2.藥物：辛伐他汀：斑馬魚腸道出血模型誘導(dǎo)劑，白色粉末，批號為404-520-2，購自日本TCI公司，用100%DMSO配制實驗用儲備液，-20℃保存?zhèn)溆谩＝∑⒁鏆鈹z血顆粒：健脾益氣攝血方配方顆粒(黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、阿膠、茜草、炙甘草)，由北京康仁堂藥物有限公司制備并提供。制備方法為單味中藥水提，噴霧干燥后，混合。臨用前用斑馬魚飼養(yǎng)水配制成100mg/ml母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.試劑與儀器：甲基纖維素(美國Sigma公司)，白色粉末。鄰聯(lián)茴香胺[批號MKBX3619V，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]。Trizol購自美國Invitrogen 公司；DEPC處理水購自上海生工公司。氯化鈉、異丙醇(分析純)、氯仿、無水乙醇等購自杭州雙天生物技術(shù)有限公司。精密電子天平(CP214，美國OHAUS公司)；解剖顯微鏡(SZX7，日本Olympus公司)；CCD相機(VertA1，上海土森視覺科技有限公司)；電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡(AZ100，日本Nikon公司)；顯微注射儀(IM-300，日本Narishige公司)。

4.藥物最大非致死濃度測定：隨機選取180尾2dpf野生型AB品系斑馬魚，設(shè)正常飼養(yǎng)對照組、健脾益氣攝血顆粒不同濃度組，每組30尾斑馬魚。在實驗過程中，每天觀察并記錄斑馬魚死亡情況，并移除死亡的斑馬魚。最后統(tǒng)計各組的斑馬魚死亡數(shù)量，得到各實驗藥物的最大非致死濃度(maximum non-lethal concentration，MNLC)。

5.建立斑馬魚腸道出血模型：基于野生型AB品系斑馬魚第1次腸道收縮發(fā)生在4dpf，進食從5dpf開始的生長規(guī)律。因此，腸道出血模型造模選擇4dpf階段。因首次在國內(nèi)建立斑馬魚腸道出血模型，探索性選定辛伐他汀誘導(dǎo)濃度為1、2、4、6和8μmol/L，誘導(dǎo)時間設(shè)置為24h，用鄰聯(lián)茴香胺染色(含 0.6mg/ml 鄰聯(lián)茴香胺、0.01mol/L 醋酸鈉、0.65% H2O2、40% 乙醇，染色15min)，并在解剖顯微鏡下觀察和記錄每組斑馬魚腸道出血數(shù)量(n)，以出血發(fā)生率評價模型是否成功。斑馬魚腸道出血發(fā)生率計算公式：出血發(fā)生率(%)=(腸道出血斑馬魚數(shù)/斑馬魚總數(shù))×100%。

6.腸道出血發(fā)生率計算：取4dpf野生型AB品系斑馬魚置于6孔板中，分別給予健脾益氣攝血顆粒不同濃度水溶液。同時，設(shè)置正常飼養(yǎng)對照組和模型對照組。每孔斑馬魚尾數(shù)為30尾，以不同濃度辛伐他汀為誘導(dǎo)劑，每孔容量為3ml，給藥24h后，在解剖顯微鏡下觀察和記錄每個實驗組腸道出血的斑馬魚數(shù)量(n)，以出血發(fā)生率為統(tǒng)計值，按照斑馬魚腸道出血發(fā)生率計算公式，評價健脾益氣攝血顆粒減少斑馬魚腸道出血發(fā)生率療效。

7.腸道出血止血率計算：隨機選取4dpf血小板熒光斑馬魚Tg(-6.0itga2b:EGFP)置于6孔板中，分別給予健脾益氣攝血顆粒不同濃度水溶液。同時，設(shè)置正常飼養(yǎng)對照組和模型對照組，每孔斑馬魚尾數(shù)為30尾，每孔容量為3ml，給藥24h后，實驗各組隨機選擇10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下，觀察腸道內(nèi)血小板聚集情況，拍照并保存圖片；利用尼康NIS-ElementsD 3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析，對每尾斑馬魚逐一計數(shù)腸道內(nèi)血小板個數(shù)(n)，以腸道內(nèi)血小板計數(shù)統(tǒng)計結(jié)果評價健脾益氣攝血顆粒的腸道止血效果。腸道止血效果計算公式：斑馬魚腸道止血率(%)=[(模型對照組腸道內(nèi)血小板計數(shù)-實驗組腸道內(nèi)血小板個數(shù))/模型對照組腸道內(nèi)血小板計數(shù)]×100%。

8.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，腸道出血發(fā)生率用Fisher′s確切檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，腸道止血效果用方差分析和Dunnett′sT檢驗分析結(jié)果，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.藥物最大非致死濃度測定：參照既往實驗結(jié)果的藥物最大致死濃度，并經(jīng)過反復(fù)實驗探索，最后確定健脾益氣攝血顆粒實驗濃度設(shè)為125、250、500、1000和2000μg/ml，在實驗過程中觀察斑馬魚死亡尾數(shù)，根據(jù)死亡尾數(shù)確定藥物最大非致死濃度，詳見表1。健脾益氣攝血顆粒2000μg/ml和1000μg/ml兩個濃度組均導(dǎo)致30/30尾斑馬魚死亡，死亡率為100%。其余各組和正常飼養(yǎng)對照組比較，無明顯毒性表型。因此，確定健脾益氣攝血顆粒對斑馬魚的MNLC為500μg/ml。在隨后的實驗中按照最大非致死藥物濃度作為遞減實驗劑量，即56、167和500μg/ml。

表1 健脾益氣攝血顆粒不同濃度下斑馬魚死亡數(shù)量

2.斑馬魚出血模型探索：隨機選取4dpf野生型AB品系斑馬魚180尾置于6孔板中，分別給予辛伐他汀1、2、4、6和8μmol/L濃度的水溶液。同時，設(shè)置正常飼養(yǎng)對照組，每孔斑馬魚尾數(shù)為30尾，每孔容量為3ml，給藥24h后，用鄰聯(lián)茴香胺染色后，在解剖顯微鏡下觀察和記錄每個實驗組腸道出血的斑馬魚數(shù)量(n)，并依據(jù)公式計算出血發(fā)生率，評價建模是否成功，詳見表2、圖1。根據(jù)造模結(jié)果，以出血量最大的辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚出血劑量，取中間數(shù)值，確定辛伐他汀6μmol/L濃度為造模劑量濃度。

表2 不同濃度辛伐他汀處理24h后斑馬魚腸道出血發(fā)生率

圖1 辛伐他汀不同濃度斑馬魚出血表型圖

3.腸道出血減少率統(tǒng)計：隨機選取4dpf野生型AB品系斑馬魚150尾于6孔板中，分別給予健脾益氣攝血顆粒56、167和500μg/ml濃度。同時，設(shè)置正常飼養(yǎng)對照組和模型對照組。每孔斑馬魚尾數(shù)為30尾，每孔容量為3ml，辛伐他汀濃度為6μmol/L，給藥24h后，在解剖顯微鏡下觀察和記錄每個實驗組腸道出血的斑馬魚數(shù)量(n)，以出血發(fā)生率評價健脾益氣攝血顆粒減少出血發(fā)生效果，詳見表3、圖2。模型對照組斑馬魚腸道出血發(fā)生率為70%，表明模型建立成功。經(jīng)健脾益氣攝血顆粒56、167和500μg/ml濃度干預(yù)后，斑馬魚腸道出血發(fā)生率分別為37%、40%和80%。其中，健脾益氣攝血顆粒56、167μg/ml兩個劑量組與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 健脾益氣攝血顆粒處理后斑馬魚腸道出血發(fā)生率

圖2 健脾益氣攝血顆粒處理后斑馬魚腸道出血表型圖綠色虛線區(qū)域為斑馬魚腸道；綠色箭頭指向腸道出血部位

4.健脾益氣攝血顆粒止血療效統(tǒng)計：隨機選取4dpf血小板熒光斑馬魚150尾于6孔板中，分別給予健脾益氣攝血顆粒56、167和500μg/ml劑量濃度水溶液。同時，設(shè)置正常飼養(yǎng)對照組和模型對照組，每孔斑馬魚尾數(shù)為30尾，每孔容量為3ml，給藥24h后，實驗各組隨機選擇10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下，觀察腸道內(nèi)血小板聚集情況、拍照并保存圖片；利用尼康NIS-Elements D 3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析，對每尾斑馬魚逐一計數(shù)腸道內(nèi)血小板計數(shù)(n)，以腸道內(nèi)血小板計數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果，評價健脾益氣攝血顆粒的腸道止血效果，詳見表4、圖3。各實驗組斑馬魚均未出現(xiàn)死亡。模型對照組斑馬魚腸道內(nèi)血小板計數(shù)為16.60個，與正常飼養(yǎng)對照組(2.20個)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。模型建立成功。以健脾益氣攝血顆粒56、167和500μg/ml濃度干預(yù)后，斑馬魚腸道內(nèi)血小板計數(shù)與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為<0.01、0.01、0.05)。腸道止血率分別為54%、52%和7%(表4)。

表4 健脾益氣攝血顆粒處理后斑馬魚腸道止血作用

圖3 健脾益氣攝血顆粒處理后腸道血小板聚集表型圖黃色虛線區(qū)域為定量分析部位

討 論

中醫(yī)認為脾具有“統(tǒng)血”功能，且有“脾為后天之本，氣血生化之源”之稱[7]。通過臨床觀察與文獻分析，免疫性血小板減少癥，尤其是慢性患者“脾不統(tǒng)血證”是臨床最常見的證候類型，而“健脾益氣攝血法”能夠針對慢性免疫性血小板減少癥病機與證候治療[8]。

免疫性血小板減少癥主要臨床表現(xiàn)除外周血血小板計數(shù)減少外，多部位不同程度出血是臨床最常見癥狀。前期基礎(chǔ)研究證實，“健脾益氣攝血顆粒”對不同濃度的辛伐他汀在不同時間誘導(dǎo)的斑馬魚腦、肝臟、心臟出血具有良好的止血效果[9]。基于這些研究結(jié)果，筆者試圖探索辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚腸道出血模型，并以健脾益氣攝血顆粒為干預(yù)藥物，觀察其對斑馬魚腸道出血的止血療效。研究結(jié)果表明，模型對照組斑馬魚腸道出血發(fā)生率為70%，經(jīng)健脾益氣攝血顆粒56、167和500μg/ml濃度干預(yù)后，斑馬魚腸道出血發(fā)生率分別為37%、40%和80%。其中，健脾益氣攝血顆粒56、167μg/ml兩個劑量組與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明健脾益氣攝血顆粒中小劑量在濃度可明顯減少斑馬魚腸道出血的發(fā)生率。模型對照組斑馬魚腸道內(nèi)血小板計數(shù)為16.60個，經(jīng)健脾益氣攝血顆粒56、167和500μg/ml濃度干預(yù)后，斑馬魚腸道內(nèi)血小板計數(shù)分別為7.60、8.00和15.50個，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為<0.01、0.01、0.05)。腸道止血作用分別為54%、52%和7%。表明健脾益氣攝血顆粒中小劑量對斑馬魚腸道出血具有明顯的止血效果。

對于上述研究結(jié)果，有兩個問題需要解釋。首先，由于觀察辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚腸道出血情況較為困難。鄰聯(lián)茴香胺主要對血紅蛋白進行著色，因此是反映紅細胞分布的指標，因此選擇鄰聯(lián)茴香胺來觀察腸道出血情況。筆者基于血小板止血的生理特點，選用轉(zhuǎn)基因血小板熒光斑馬魚Tg(-6.0itga2b:EGFP)為模式動物，以腸道出血部位血小板聚集現(xiàn)象判斷止血效果(血小板在出血部位聚集，有利于出血部位止血)。這一方法在國內(nèi)尚屬首次，可能存在著一定的局限性，有待于進一步探究。其次，在模型對照組和藥物組中觀察到斑馬魚肝臟也有明顯的出血，而且肝臟中有大量的血小板聚集。這一現(xiàn)象表明健脾益氣攝血顆粒并未引起血小板生成減少，而是對腸道出血有止血療效。健脾益氣攝血顆粒小劑量(56μg/ml)與中劑量(167μg/ml)不但能夠明顯減少斑馬魚腸道出血率，也有良好的止血療效。但大劑量(500μg/ml)沒有明顯的止血效果，其可能的解釋是適當劑量(中小劑量)的健脾益氣攝血顆粒具有止血效果，而大劑量可能是由于中藥多成分、多靶點而出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)，但這一解釋并沒有得到臨床研究數(shù)據(jù)的證實，需要進行不同劑量的臨床療效探索性研究，進而為臨床合理用藥提供依據(jù)。