利拉魯肽對糖尿病肥胖大鼠內臟脂肪的調節作用

肖 珊 楊 燁 劉玥彤 馬 瑞 朱 筠

RegulatoryEffectofLiraglutideonVisceralFatinDiabeticObeseRats.XiaoShan，YangYe，LiuYuetong,etal.DepartmentofEndocrinology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Xinjiang830054，China

AbstractObjectiveTo explore the effect of liraglutide on the expression of fat mass and obesity-associated(FTO)、AMP-activated protein kinas(AMPK) and protein kinase B(AKT) in visceral adipose tissue of diabetic obese rats and its possible mechanism.MethodsTwenty male SD rats of SPF grade were randomly divided into two groups (10 rats in each group). They were treated with liraglutide [0.6mg/(kg·d)]or saline respectively. After 12 weeks, the rats were weighed and the samples were collected. The weight of visceral adipose tissue and the levels of blood glucose, TG, TC, HDL-C and LDL-C were measured. The expression of FTO, AMPK and Akt in visceral adipose tissue was detected by RT-PCR and Western blot.T-test was used to analyze and compare the data of each group.ResultsThe results showed that compared with the control group, the body weight, visceral fat weight, blood glucose, TG, TC, LDL-C levels of rats in the liraglutide group were significantly lower (P<0.05), while the HDL-c levels were significantly higher (P<0.05). Compared with the control group, the levels of FTO, Akt mRNA and protein decreased significantly in the liraglutide group (P<0.05), and the levels of AMPK mRNA and protein increased significantly (P<0.05).ConclusionLiraglutide may be involved in the improvement of abdominal obesity in type 2 diabetes by activating AMPK pathway and inhibiting Akt pathway in visceral fat and down regulating the expression of FTO.

KeywordsLiraglutide; Diabete mellitus; FTO;AMPK;AKT

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是目前常見的慢性疾病，隨著生活方式的改變及人口老齡化的加速，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)和肥胖的發生率呈快速上升的趨勢，并且已經成為全球性的公共衛生問題。其中，超重和腹型肥胖是T2DM的主要危險因素，可加重T2DM患者的胰島素抵抗，影響血糖控制的效果[1]。脂肪量及肥胖相關(fat mass and obesity-associated，FTO)基因是由Frayling等[2]和Susleyici-Duman等[3]研究發現，在脂肪組織內可豐富表達的肥胖相關性基因。據報道，FTO基因的翻譯蛋白可能會作為轉錄輔助因子調控脂肪細胞的生長和發育，調節脂肪細胞的成脂功能，影響肥胖的發生過程[4]。

多項研究表明，FTO的多態性基因與肥胖及T2DM密切相關[5]。有研究發現，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinas，AMPK)是調控脂質代謝的關鍵因子，在骨骼肌細胞中可通過抑制FTO的表達減少脂質的積累[6]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號通路則是2型糖尿病發生、發展的經典通路，PI3K/AKT途徑相關信號蛋白的活化在調節體內脂質的代謝及胰島素抵抗中發揮重要作用。

利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1受體激動劑(glucagon like peptide-1 receptor agonists，GLP-1 RAs)，可通過胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)受體的介導發揮類似GLP-1的調節作用，以葡萄糖濃度依賴的方式促進胰島素的分泌，抑制胰高血糖素的釋放，維持血糖的穩定狀態[7]。此外，GLP-1RAs還可通過延緩胃排空、增加飽腹感、抑制食欲來減少能量的攝取，對能量的平衡和體質量的控制產生直接的影響作用[8]。研究顯示，長期聯合應用利拉魯肽治療T2DM可顯著降低超重及腹型肥胖T2DM患者的體質量，改善高脂血癥，減少心血管疾病的發生風險[9]。

研究發現，在db/db小鼠中，利拉魯肽可以通過激活AMPK、抑制AKT來降低體質量，減少內臟脂肪的產生[10]。因此，本研究利用高脂高糖飼料及鏈脲佐菌素 (streptozotocin，STZ)誘導的2型糖尿病肥胖大鼠模型，觀察代謝狀態及內臟脂肪組織中FTO、AMPK、AKT的表達水平的變化，探索利拉魯肽對糖尿病肥胖大鼠內臟脂肪組織中FTO、AMPK及AKT表達的影響及其調節糖尿病肥胖大鼠內臟脂肪的可能機制。

材料與方法

1.主要材料：清潔級(SPF級)雄性SpragueDawley(SD)大鼠由新疆醫科大學動物中心實驗室提供，所需的高脂高糖飼料由北京博泰宏達生物技術有限公司提供。STZ購自美國Sigma公司，利拉魯肽注射液購自丹麥諾和諾德公司，FTO、AMPK及AKT引物購自華大基因有限公司，RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒及實時熒光定量RT-PCR試劑盒均購自德國Qiagen公司，FTO、AMPK及AKT抗體購自美國Abcam公司。

2.糖尿病模型的制備及分組：20只SPF級雄性SD大鼠，體質量約180～220g，普通飼料適應性喂養1周后，給予高脂高糖飼料喂養8周，待體質量增長至400～450g時腹腔注射STZ 30mg/kg，繼續予高脂高糖飼料喂養，3天后尾靜脈取血，測隨機血糖≥16.7mmol/L，提示糖尿病模型建造成功。將20只糖尿病模型大鼠隨機分成利拉魯肽組和對照組，每組各10只，分別給予利拉魯肽[0.6mg/(kg·d)]或0.9%氯化鈉溶液每天2次皮下注射，并持續給予高脂高糖飼料喂養及血糖監測。本研究經新疆醫科大學實驗動物使用和管理(IACUC)批準，嚴格按照動物實驗申請書進行實驗操作，嚴格遵守實驗動物科學研究部的各項規章制度和條例以及《動物保護法》及相關法規的規定。

3.標本的收集與處理：在利拉魯肽或0.9%氯化鈉溶液干預12周后，禁食過夜，稱體質量，以3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血。采血結束后，分離內臟脂肪組織標本，稱重后將脂肪組織放入EP管，迅速放入液氮中，隨后移至-80℃超低溫冰箱中凍存備用。

4.血清生化指標的檢測：將新鮮的血液離心后，取上層血清置于冰上待測。根據相關試劑盒說明進行操作，利用酶標分析儀測定吸光度值，并計算血清葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白的含量。

5.實時熒光定量RT-PCR：取各組大鼠內臟脂肪組織，根據試劑盒提取總RNA，反轉錄為相應的cDNA，進行實時熒光定量RT-PCR，引物序列見表1。FTO、AMPK及AKT mRNA的表達水平測定的PCR反應總體系20μl，PCR擴增條件：95℃變性10min，60℃退火1min，95℃延伸15s，40個循環，每個樣本設3復孔，以β-actin作為參照。

表1 引物序列

6.Western blot法檢測：取適量液氮凍存的內臟脂肪組織，加入含磷酸酶抑制劑和蛋白酶的裂解液，超聲破碎后4℃超速離心15min，收集上清液，BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，取變性蛋白20微克/孔，10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳后按濕轉法將產物轉印到聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，使用含5%牛血清蛋白室溫條件下封閉2h，加入一抗(FTO 1∶1000；AMPK 1∶2000；AKT 1∶1000；β-actin 1∶2000)在4℃條件下孵育過夜，TBST洗膜3次后加入HRP標記的二抗(1∶10000)在室溫條件下孵育2h，洗膜3次，高敏化學發光法(ECL)處理，利用凝膠定量分析系統檢測蛋白含量，以所得條帶的吸光度與β-actin內參照吸光度的比值代表其表達量。

結 果

1.兩組體質量及內臟脂肪的比較：與對照組比較，利拉魯肽組大鼠體質量、內臟脂肪的重量明顯降低(P<0.05，表2)。

表2 兩組體質量及內臟脂肪重量

2.兩組血糖及血脂水平的比較：與對照組比較，利拉魯肽組大鼠血糖、血清TG、TC、LDL-C水平明顯降低，HDL-C水平明顯升高(P<0.05，表3)。

3.兩組內臟脂肪中FTO、AMPK及AKT的表達水平比較：與對照組比較，利拉魯肽組大鼠內臟脂肪FTO、AKT mRNA及蛋白的水平明顯降低(P<0.05)，AMPK mRNA及蛋白的水平明顯升高(P<0.05，表4、表5，圖1)。

表3 兩組血糖及血脂水平

表4 兩組內臟脂肪中FTO、AMPK及AKT mRNA 表達

表5 兩組內臟脂肪中FTO、AMPK及AKT 蛋白表達

圖1 兩組FTO、AMPK及AKT 蛋白的表達

討 論

多項研究顯示，FTO rs8050136位點的A等位基因既與胰島素抵抗及炎性因子顯著相關，又與BMI、腰圍及臀圍等肥胖標志物的升高存在密切聯系[11,12]。同樣，FTO rs9939609位點的多態性也與高血脂、肥胖及靶組織受體介導的胰島素代謝改變顯著相關。研究發現， SIRT-AMPK信號通路的激活可降低脂肪酸合酶及其轉錄因子的表達，增加脂肪酸的氧化速率，調節脂質的分解及能量代謝的過程[13～15]。在高脂誘導的C57BL/6小鼠發生肥胖的過程中，活化的AMPK可明顯降低小鼠肝臟脂肪堆積，同時還可通過抑制糖異生途徑達到抗糖尿病的作用。研究顯示，胰島素敏感的PI3K/AKT信號轉導，可影響體內葡萄糖的平衡及脂質的穩態[16]。PI3K/AKT信號通路還參與聚焦低能量沖擊波進行脂肪干細胞培養的過程[17]。肝臟脂質聚積時，抑制PI3K/AKT信號通路，可促進肝細胞自噬，減輕db/db小鼠的肝脂肪變[18]。研究表明，FTO基因在癌細胞中的表達水平明顯升高，可能通過PI3K/AKT途徑調控細胞代謝，參與細胞的生長，而AMPK的活化則可抑制FTO基因的表達[19]。

本研究探索拉魯肽對糖尿病肥胖大鼠內臟脂肪FTO、AMPK及AKT表達水平的影響及其可能機制。有研究證實，利拉魯肽在改善血糖的同時可降低載脂蛋白Ⅲ的表達，調節高血糖患者甘油三酯的水平，減少動脈粥樣硬化殘余脂蛋白顆粒[20]。肥胖患者中，利拉魯肽可通過恢復其內皮功能，降低心血管事件的發生風險[21，22]。研究發現，利拉魯肽是通過激活PKA-AMPK信號通路來改善高脂誘導的肥胖小鼠的代謝狀態及血管功能障礙，提高抗氧化的能力，發揮保護心血管系統的作用[23]。研究顯示，抑制AKT的活性可減少脂質的合成。在MDA-MB-231細胞中AMPK則可通過激活PP2A來刺激AKT/PKB的去磷酸化，影響AKT的活性。糖尿病肥胖小鼠在經利拉魯肽治療后，其腎周、附睪及大網膜脂肪構成的內臟脂肪組織AMPK的激活及AKT的抑制可導致內臟脂肪重量的降低，減輕糖尿病肥胖小鼠的體質量[10]。

本研究結果顯示，糖尿病肥胖大鼠經利拉魯肽治療后，與對照組比較，體質量及內臟脂肪的重量明顯降低(P<0.05)，血糖、TG、TC、LDL-C水平也明顯降低(P<0.05)，而HDL-C水平則明顯升高(P<0.05)；利拉魯肽組大鼠內臟脂肪FTO、AKT mRNA及蛋白的水平明顯降低(P<0.05)，AMPK mRNA及蛋白的水平明顯升高(P<0.05)，這提示利拉魯肽可能通過激活糖尿病肥胖大鼠內臟脂肪AMPK途徑及抑制AKT途徑，下調FTO的表達水平，改善2型糖尿病的腹型肥胖。但利拉魯肽通過FTO、AMPK及AKT途徑改善2型糖尿病內臟脂肪蓄積的具體調節機制尚未明確，仍是需要研究的方向。

綜上所述，利拉魯肽改善糖尿病腹型肥胖的過程可能通過激活內臟脂肪中的AMPK途徑及抑制AKT途徑，下調FTO的表達水平來實現，為2型糖尿病及腹型肥胖的防治提供新的理論依據。