去鐵胺對糖尿病大鼠心肌細(xì)胞鐵死亡通路的影響

李浩甲 楊文曲 韓沖芳 賀建東 王文杰 任鵬鵬

EffectofDeferoxamineonFerroptosisofMyocardialCellinDiabeticRats.LiHaojia,YangWenqu,HanChongfang,etal.DepartmentofAnesthesiology,ShanxiMedicalUniversity,Shanxi030001,China

AbstractObjectiveTo investigate the effect of deferoxamine on ferroptosis of myocardial cell in diabetic rats.Methods24 male SD rats weighing 240-290g were randomly divided into 3 groups (n=8 each):Group N was continuously feeded by normal fodder for 4 weeks; group D was induced via intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ)55mg/kg and fed by normal fodder for 4 weeks; group C was induced by injection of streptozotocin (STZ)55mg/kg and DFO 0.2mg/g during the forth week. The weight and blood glucose were monitored in rats on 1st, 3rd, 10th, 17th, 24th and 31st days. The blood was taken for test of cTnI on 31st day. The pathological changes were observed by HE staining and Prussian blue staining. Western blot was used to determine the expression of microtubule associated protein 3 Ⅱ(LC3Ⅱ), ferritin heavy chain (FTH) and nuclear receptor coactivator 4(NCOA4).ResultsCompared with group N, the blood glucose level increased, the body weight decreased in group D and C; the expression of cTnI， FTH, NCOA4 and LC3Ⅱwere significantly up-regulated in the group D. Compared with group D, the expression of cTnI, FTH, NCOA4, LC3Ⅱand blood glucose on 31st day were down-regulated in the group C. The iron content was less in group C.ConclusionDesferrioxamine treatment for 1 week could decrease the level of blood glucose, decrease the concentration of cTnI， inhibit the expression of NCOA4 in myocardial cell, inhibit the ferroptosis pathway, and alleviate the injury of myocardial cell.

KeywordsDeferoxamine; Diabetic; Ferroptosis

糖尿病患者往往伴隨多器官功能的下降，高血糖造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的損傷增加了糖尿病患者心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，鐵過載激活的鐵死亡通路與糖尿病心肌細(xì)胞損傷密切相關(guān)[2]。去鐵胺是一種鐵螯合劑，結(jié)合游離Fe3+形成絡(luò)合物隨尿液排出體外，去鐵胺可以降低糖尿病大鼠體內(nèi)鐵含量，改善胰島素抵抗，減輕糖尿病心肌損傷，但具體機(jī)制尚未完全清楚[3，4]。核受體共同激活因子4(NCOA4)在鐵死亡通路中介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白自噬，導(dǎo)致鐵離子增多，引發(fā)細(xì)胞損傷[5]。本研究推測去鐵胺可能通過抑制NCOA4的表達(dá)，起到心肌保護(hù)的作用，通過觀察去鐵胺對糖尿病大鼠心肌細(xì)胞鐵死亡通路的影響，探討去鐵胺改善糖尿病心肌損傷的機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：體質(zhì)量240～290g的健康成年雄性SD大鼠24只，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；注射用甲磺酸去鐵胺(諾華制藥有限公司)；鐵蛋白重鏈(FTH)、核受體共同激活因子4(NCOA4)、微管相關(guān)蛋白3(LC3Ⅱ)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國ABclonal公司。

2.實(shí)驗(yàn)分組：大鼠適應(yīng)1周后，采用數(shù)字表法隨機(jī)將其分為3組(n=8)：正常組(N組): N組大鼠在禁食8h后經(jīng)腹腔注射10ml/kg枸櫞酸鈉緩沖液。普通飼料喂養(yǎng)，飲水飼料供應(yīng)充足，保持墊料干燥；糖尿病組(D組):大鼠在禁食8h后，采用頭低位腹腔注射STZ 55mg/kg，濃度10mg/ml，其他條件同N組；去鐵胺處理組(C組)：采用與D組相同的方法制備糖尿病模型，于第24天開始每日腹腔注射去鐵胺0.2mg/g，濃度50mg/ml，持續(xù)1周。3組大鼠于注射當(dāng)天、第3天、10天、17天、24天、31天監(jiān)測日間隨機(jī)血糖和體質(zhì)量。

3.血漿cTnI測定：于建模后第31天，采用斷尾法采血2.5ml，收集于抗凝采血管中，4℃離心機(jī)12000r/min離心10min，取約1ml血漿，使用全自動(dòng)動(dòng)物血液生化儀測血漿cTnI濃度。

4.病理學(xué)染色：采血后采用脊椎脫臼法處死大鼠，取心臟組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗后置于-80℃度冰箱冷凍5min。垂直于心臟長軸切成厚4mm的標(biāo)本，經(jīng)過固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片，制成4μm厚標(biāo)本切片。HE染色采用蘇木精染液染色5min，伊紅染液染色1min制備；普魯士藍(lán)染色采用普魯士藍(lán)染液染色30min，核固紅染液染色10min，之后透明、封片。

5.Western blot法檢測：每只大鼠的心肌取500g組織，加入RIPA裂解液10μl/mg和PMSF蛋白酶抑制劑0.1μl/mg，提取總蛋白。每份樣品取50μg，選擇12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜。37℃脫脂牛奶封閉2h，分別加入鐵蛋白重鏈單克隆抗體(FTH，1∶1000)；核受體共同激活因子4單克隆抗體(NCOA4，1∶1000)；微管相關(guān)蛋白3單克隆抗體(LC3Ⅱ，1∶1000)和內(nèi)參抗-甘油醛-3-磷酸脫氫酶單克隆抗體(GAPDH，1∶1000)孵育過夜。洗膜后加入HRP二抗山羊抗兔(1∶1000)孵育2h，自動(dòng)曝光儀曝光顯影。采用Image J軟件測定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反映表達(dá)。

結(jié) 果

1.大鼠基本情況的變化：3組大鼠基礎(chǔ)體質(zhì)量、基礎(chǔ)血糖值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與N組比較，D組、C組在注射STZ第3天、10天、17天、24天、31天監(jiān)測日間隨機(jī)血糖明顯升高(P<0.05)，D組、C組體質(zhì)量在第17天、24天、31天明顯降低(P<0.05，表1、表2)。

表1 3組大鼠隨機(jī)血糖值比較

表2 3組大鼠體質(zhì)量變化比較

2.大鼠心肌細(xì)胞鐵蛋白自噬相關(guān)蛋白變化：與N組比較，D組和C組大鼠血清cTnI含量增加，D組心肌細(xì)胞LC3Ⅱ、FTH、NCOA4表達(dá)增多，C組心肌細(xì)胞FTH、LC3Ⅱ、NCOA4含量降低(P<0.05)；與D組比較，C組大鼠血清cTnI含量降低，心肌細(xì)胞FTH、LC3Ⅱ、NCOA4含量降低(P<0.05，表3)。

表3 3組大鼠cTnI濃度、LC3Ⅱ、FTH、NCOA4比較

3.大鼠心肌病理學(xué)改變：光鏡下可見N組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，普魯士藍(lán)染色顯示細(xì)胞內(nèi)有少量含鐵小粒；D組心肌纖維排列松散，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)染色加深，細(xì)胞內(nèi)有較多含鐵小粒；C組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，胞質(zhì)染色較均勻，但細(xì)胞間連接不緊密，出現(xiàn)少量空泡，與D組比較，C組含鐵小粒明顯減少(圖1、圖2)。

圖1 心肌組織HE染色(×200)

圖2 心肌組織普魯士藍(lán)染色(×400)為含鐵小粒

討 論

STZ通過破壞大鼠胰島β細(xì)胞，造成胰島素分泌不足，制備糖尿病大鼠模型。本研究選擇單次腹腔注射STZ 55mg/kg，注射STZ 3天后，D組和C組靜脈血糖值均>16.7mmol/L，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕的表現(xiàn)，表明成功制備糖尿病大鼠模型。參照文獻(xiàn)[6]，C組采用腹腔注射去鐵胺0.2mg/g連續(xù)1周的方法處理糖尿病大鼠，C組cTnI濃度、隨機(jī)血糖值下降，心肌細(xì)胞損傷減輕，說明去鐵胺對糖尿病大鼠有一定的器官保護(hù)作用。

研究表明，鐵蛋白自噬增強(qiáng)是促進(jìn)糖尿病發(fā)生的重要途徑之一[7]。有6.6%的2型糖尿病患者中伴隨高鐵蛋白血癥，升高的鐵蛋白與胰島素抵抗相關(guān)，而不是與胰島素產(chǎn)生相關(guān)[8]。鐵蛋白自噬增強(qiáng)，釋放出游離的鐵離子，加速細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生[9]。NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白自噬是鐵死亡通路的重要組成部分，它可以特異性識(shí)別鐵蛋白重鏈，并連接自噬體上的LC3，在溶酶體完成鐵蛋白自噬，游離的鐵離子釋放到胞質(zhì)中，通過芬頓反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧自由基損傷，特別是細(xì)胞器膜脂質(zhì)分子受到氧自由基攻擊后形成脂質(zhì)過氧化物，影響細(xì)胞器功能、激活凋亡通路等[10，11]。本研究中D組大鼠NCOA4、FTH、LC3Ⅱ表達(dá)增加，cTnI濃度升高，心肌細(xì)胞含鐵小粒數(shù)量增加，提示糖尿病組心肌細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白自噬增加，細(xì)胞損傷加重。

去鐵胺作為一種鐵螯合劑，臨床上主要用于治療地中海貧血，輸血引起的鐵負(fù)荷過重，可以結(jié)合Fe3+形成水溶性絡(luò)合物，并隨尿液排出體外[12]。有研究顯示，去鐵胺在改善糖尿病胰島素抵抗、減輕心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用，但其中的機(jī)制仍不明確[13，14]。本研究中C組大鼠在注射去鐵胺1周后，心肌細(xì)胞NCOA4、FTH、LC3Ⅱ表達(dá)降低，血糖水平也比D組降低，說明去鐵胺的作用可能與抑制細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白自噬通路有關(guān)。雖然去鐵胺處理后血糖水平未恢復(fù)正常，但是大鼠心肌細(xì)胞損傷明顯減輕。張東等[15]研究發(fā)現(xiàn)，采用去鐵胺20mg/(kg·d)干預(yù)糖尿病大鼠2個(gè)月，血糖水平仍高于正常，但是可以在一定程度上減輕糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松的形成。

綜上所述，去鐵胺可以抑制糖尿病大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)NCOA4的表達(dá)，抑制鐵蛋白自噬，減輕鐵死亡，降低血糖水平和cTnI濃度，起到心肌保護(hù)的作用。本研究為糖尿病的臨床治療提供了新思路。