加貝酯對腦缺血再灌注大鼠神經細胞凋亡的影響及機制研究

喬建新 劉熙鵬 劉 明 曹 兵

EffectofGabexateMesilateonNeuronalApoptosisinRatswithCerebralIschemiaReperfusionandItsMechanism.QiaoJianxin,LiuXipeng,LiuMing,etal.TheFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Hebei075000,China

AbstractObjectiveTo investigate the effect of Gabexate Mesilate (GM) on neuronal apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion (I/R) rats and explore its mechanism.MethodsTotally 120 male SD rats were randomly divided into Sham group, I/R group, nimodipine (NMP) 2mg/(kg·d) group and GM 5, 10, 20mg/(kg·d) group,n=20.The rat model with cerebral ischemia-reperfusion was prepared by blocking the middle cerebral artery for 2 hours, and the drugs were given by tail vein injection after the model was completed, once a day for 7 days. The pathological change of brain tissue was examined by HE staining and the apoptosis was observed by TUNEL. The antioxidant enzyme (SOD, GSH-Px) activity and MDA content in brain tissue were determined by biochemical analysis. The expression of cleaved caspase-3, NF-κB, endoplasmic reticulum stress apoptotic pathway related protein(p-JNK, CHOP) were determined by Western blot.ResultsCompared with I/R group, the brain tissue morphological changes and cell damage in GM 10, 20mg/(kg·d) and NMP 2mg/(kg·d) groups were significantly improved, the cell apoptosis were significantly improved and the AI were decreased, the activity of SOD, CAT were increased and the content of MDA was decreased. The expression of cleaved caspase-3, NF-κB, p-JNK, CHOP were down-regulated. All of the differences were significant (P<0.05 orP<0.01). Compared with NMP 2mg/(kg·d) group, the brain tissue lesions and apoptotic conditions were better in GM 20mg/(kg·d) group. The AI was decreased, the SOD activity was increased and MDA content was decreased, the expression of NF-κB, p-JNK, CHOP were down-regulated, all of the differences were significant (P<0.05).ConclusionGM can inhibit neuronal apoptosis in brain I/R rats, which may be related to inhibiting oxidative stress, down-regulating cleaved caspase-3 and NF-κB protein expression and blocking the endoplasmic reticulum stress apoptotic pathway related.

KeywordsGabexate Mesilate; Cerebral ischemia-reperfusion; Apoptosis; Endoplasmic reticulum stress; Oxidative stress

缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，約占腦卒中患者的80%，具有較高的致殘、致死率和復發率，恢復時間長且預后不理想，給家庭和社會帶來沉重負擔。及時恢復血流再灌注挽救缺血半暗帶神經元是改善預后的關鍵，但病理生理學研究發現，缺血性腦卒中及實現再灌注后將導致缺血區線粒體能量代謝障礙、呼吸鏈受阻而誘發活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)大量產生，導致缺血半暗帶神經元凋亡而加重缺血性腦損傷[1～3]。加貝酯(gabexate mesilate，GM)是一種非肽類酶抑制劑，目前臨床上用于治療急性輕型(水腫型)胰腺炎，有研究發現，GM能夠通過抑制氧化應激、細胞凋亡而對肝臟缺血再灌注損傷、小腸缺血再灌注損傷起到保護作用[4,5]。但GM是否對腦缺血再灌注大鼠神經細胞凋亡具有抑制作用的文獻報道尚不多見。

材料與方法

1.材料：(1)藥物與試劑：注射用甲磺酸加貝酯(GM，成都天臺山制藥有限公司)；注射用尼莫地平(北京四環科寶制藥有限公司)；SOD、GSH-Px、MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；cleaved caspase-3、NF-κB、c-Jun 氨基端激酶(p-JNK)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、β-actin單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)。(2)實驗動物：SPF級雄性SD大鼠120只，體質量230±10g，購自承德醫學院實驗動物中心 [實驗動物許可證號：SCXK(冀)2017-001]；適應性飼養1周后進行實驗，飼養環境：溫度25±1℃、相對濕度60%±5%、12h光照黑暗交替，自由飲水進食。

2.動物分組、造模與給藥：(1)分組：對120只SD大鼠進行編碼后，按照數字表法隨機分為6組，即假手術組(Sham組)，I/R組，NMP 2mg/(kg·d)組和GM 5、10、20mg/(kg·d)組，每組20只。(2)腦I/R模型制備[6]：手術前12h禁食不禁水，實施麻醉后沿頸部正中切口，夾閉頸總動脈并結扎頸外動脈后，由頸外動脈切口并插入直徑0.235mm的線栓進入頸內動脈，遇阻力止，固定線栓后逐層縫合皮膚并擦拭碘伏進行消毒處理，2h后撤出線栓實現再灌注；Sham組除不插入線栓外，其余同模型組。(3)給藥：精確稱取GM和NMP粉針劑加入適量0.9%氯化鈉溶液制備濃度5、10、20mg/ml的GM溶液和濃度2mg/ml 的NMP溶液；造模完成后，GM 5、10、20mg/(kg·d)組尾靜脈注射濃度5、10、20mg/ml的GM溶液，NMP 2mg/(kg·d) 組同步給予濃度2mg/ml的NMP溶液，假手術組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液，注射劑量均為1ml/kg，1次/天連續7天。給藥完成6h后行各指標檢測。

3.腦組織病理學檢查和神經細胞凋亡觀察：各組隨機選取10只大鼠，麻醉后開胸暴露心臟，心臟灌注300ml 0.9%氯化鈉溶液、300ml 4%多聚甲醛溶液后斷頭取腦，去除小腦和腦干后置4%多聚甲醛溶液繼續固定72h，依次行脫水、透明、石蠟浸潤包埋和4μm厚度連續切片、脫蠟水化處理后，行HE染色(蘇木精染色10min、0.5%鹽酸乙醇分化3s、95%乙醇1min、0.5%伊紅乙醇染色1min、80%乙醇分化3s后脫水)、中性樹膠封片，然后通過光學顯微鏡觀察腦組織病理學改變；遵照試劑盒操作說明行TUNEL染色，脫水后用50%甘油封片，通過光學顯微鏡觀察并拍照；凋亡指數(AI)計算：每只大鼠取5張同位置切片，分別取5個不重疊視野計數凋亡細胞數(細胞核黃褐色為陽性著色)和細胞總數，AI(%)=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%

4.腦組織生化指標檢測：各組取剩余10只大鼠，頸部脫臼處死后迅速斷頭取腦組織，冰上取右側大腦，加入9倍量冷裂解液行研磨勻漿，4℃離心(離心半徑15cm、3500r/min、10min)取上清液，采用黃嘌呤氧化酶法、二硫對硝基甲酸法測定SOD、GSH-Px活性，硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量。

5.腦組織蛋白表達檢測：采用Western blot法檢測，腦組織勻漿液經4℃離心(離心半徑15cm、12000r/min、30min)取上清液，提取總蛋白并檢測濃度后上樣20μg，SDS-PAGE凝膠電泳分離(80V電壓濃縮膠電泳后120V電壓分離膠電泳)、轉PVDF膜后5%脫脂牛奶室溫封閉1h后，滴加兔抗鼠cleaved caspase-3、NF-κB、p-JNK、CHOP、β-actin一抗恒4℃孵育過夜，洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗37℃孵育1h，洗膜后滴加DAB顯色；以β-actin為內參，以條帶灰度值半定量目標蛋白表達量。

結 果

1.GM對腦I/R大鼠腦組織病理學改變的影響：Sham組大鼠神經細胞形態結構未見異常，I/R組呈現神經細胞數量減少、間隙增大，形態不規則、排列紊亂，胞膜邊界不清，出現空泡變性，胞核固縮深染等病理學改變；GM各劑量組和NMP 2mg/(kg·d)組大鼠神經細胞缺血性病理改變不同程度減輕，與I/R組比較，GM 20mg/(kg·d)組缺血性病理改變明顯減輕(圖1)。

圖1 GM對腦I/R大鼠腦組織病理學改變的影響(HE，×200)A.Sham組；B.I/R組；C.GM 5mg/(kg·d)組；D.GM 10mg/(kg·d)組；E.GM 20mg/(kg·d)組；F.NMP 2mg/(kg·d)組

2.GM對腦I/R大鼠神經細胞凋亡的影響：Sham組大鼠腦組織可見極少量凋亡細胞，I/R組凋亡細胞數量明顯增多、AI較Sham組顯著升高(65.37%±5.52% vs 2.45%±0.83%，P<0.01)。GM 5、10、20mg/(kg·d)組和NMP 2mg/(kg·d)組凋亡神經細胞數量明顯減少，AI較I/R組顯著降低(54.18%±5.06%、46.72%±4.98%、24.37%±4.05%、38.51%±4.24% vs 65.37%±5.52%，P<0.01)。與 NMP 2mg/(kg·d)組比較，GM 20mg/(kg·d)組AI顯著降低(P<0.01，圖2)。

圖2 GM對腦I/R大鼠神經細胞凋亡的影響(TUNEL，×200)A.Sham組；B.I/R組；C.GM 5mg/(kg·d)組；D.GM 10mg/(kg·d)組；E.GM 20mg/(kg·d)組；F.NMP 2mg/(kg·d)組

3.GM對腦I/R大鼠腦組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響：與Sham組比較，I/R組腦組織SOD、GSH-Px活性顯著降低而MDA含量顯著升高(P<0.01)；與I/R組比較，GM 10、20mg/(kg·d)組和NMP 2mg/(kg·d)組SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)；與NMP 2mg/(kg·d)組比較，GM 20mg/(kg·d)組SOD活性顯著升高，MDA顯著降低(P<0.05)，兩組間GSH-Px活性比較差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 GM對腦I/R大鼠腦組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

4.GM對腦I/R大鼠腦組織cleaved caspase-3、NF-κB、p-JNK、CHOP蛋白表達的影響：與Sham組比較，I/R組腦組織cleaved caspase-3、NF-κB、p-JNK、CHOP蛋白表達顯著上調(P<0.01)；與I/R組比較，GM 10、20mg/(kg·d)組和NMP 2mg/(kg·d)組cleaved caspase-3、NF-κB、p-JNK、CHOP蛋白表達下調(P<0.05或P<0.01)。與NMP 2mg/(kg·d)組比較，GM 20mg/(kg·d)組NF-κB、p-JNK、CHOP蛋白表達顯著下調(P<0.01)，兩組間cleaved caspase-3表達比較，差異無統計學意義(P>0.05，圖3、圖4，表2)。

圖3 GM對腦I/R大鼠腦組織cleaved caspase-3、NF-κB蛋白表達的影響

圖4 GM對腦I/R大鼠腦組織p-JNK、CHOP蛋白表達的影響

表2 GM對腦I/R大鼠腦組織cleaved caspase-3、NF-κB、p-JNK、CHOP蛋白表達的影響

討 論

缺血性腦血管病是威脅人類健康的常見病和多發病，細胞凋亡是缺血性腦損傷進一步加重的病理關鍵[7～9]。本研究通過線栓法制備腦I/R大鼠模型，其腦組織呈現神經細胞數量減少、排列紊亂、胞膜邊界不清、胞核固縮深染等病理性改變并且神經細胞凋亡數量明顯增多，與刁長會等[10]研究報道一致。GM是一種非肽類酶抑制劑，具有抗氧化和抑制細胞凋亡的藥理學作用，本研究發現，經GM干預治療7天能夠明顯改善腦I/R大鼠腦組織缺血性病變并抑制神經細胞凋亡，并且GM 20mg/(kg·d)組治療效果優于臨床一線用藥NMP組效果，提示GM具有抑制腦I/R大鼠腦神經細胞凋亡并改善腦組織病變的作用。

細胞凋亡是一種受多種基因蛋白和信號通路調控的細胞程序化死亡過程， cleaved caspase-3能夠酶解切割細胞結構蛋白、修復蛋白等而破壞細胞內環境穩定，從而參與細胞凋亡啟動和執行過程[11，12]。腦缺血再灌注后由于能量代謝障礙、線粒體呼吸鏈破壞將導致ROS大量產生，以ROS為底物的抗氧化酶SOD、GSH-Px合成受阻并過度消耗而導致ROS過剩，ROS直接攻擊細胞膜及核酸、蛋白質等高分子發生脂質過氧化而破壞其結構，生成具有生物毒性的MDA；并且ROS能夠激活NF-κB蛋白，活化后的NF-κB能夠刺激促凋亡調控因子合成和釋放而促進細胞凋亡[13～15]。

內質網是一種膜性細胞器，參與調節鈣穩態、脂質合成和展開過程稱為內質網應激，適度的內質網應激對細胞起保護作用、過度則促進細胞凋亡[16]。李爽[17]、翟美麗等[18]研究發現，內質網應激通路在缺血性腦損傷所致細胞凋亡過程中具有重要的調控作用。內質網應激通路活化與CHOP、JNK蛋白表達上調有關,而ROS則能夠促進CHOP、p-JNK蛋白表達而激活內質網應激通路[19，20]。

本研究發現，經GM干預治療7天能夠降低腦I/R大鼠腦組織MDA含量并提高SOD、GSH-Px活性，下調cleaved caspase-3、NF-κB、p-JNK、CHOP蛋白表達，并且GM 20mg/(kg·d)組對MDA含量、SOD活性以及NF-κB、p-JNK、CHOP表達的調控作用優于NMP組，提示GM通過抑制氧化應激、下調cleaved caspase-3和NF-κB蛋白表達、阻斷內質網應激凋亡通路，抑制腦I/R大鼠神經細胞凋亡，減輕腦組織損傷。