甲基乙二醛通過ROS-MCU途徑誘導成骨細胞凋亡的研究

金 杯 戴盼盼 孫 旺 顧衛燕 林海升 施更生

EffectofMethylglyoxalontheApoptosisofOsteoblasticCellsbyROS-MCUSignalingPathway.JinBei,DaiPanpan,SunWang,etal.DepartmentofStomatology,TaizhouHospital,WenzhouMedicalUniversity,Zhejiang317000,China

AbstractObjectiveTo explore the effect and mechanism of methylglyoxal (MG) on osteoblast apoptosis through ROS-MCU signaling pathway.MethodsLogarithmic growth phase MC3T3-E1 were divided into 4 groups: control group,MG group, NAC group, NAC+MG group. Cell viability was evaluated by MTT assays. The apoptosis rate was analyzed by flow cytometry and TUNEL assays. The protein expression level of MCU was detected by western blotting.ResultsAs compared with control group, MG decreased the number of viable cells．Flow cytometric analysis, TUNEL staining showed an increase in the incidence of apoptosis. What′s more, MG increased the expression of MCU. As expected, NAC pretreatment greatly improved the viability of cells exposed to MG and attenuated MG-induced apoptosis. Furthermore, NAC treatment markedly decreased level of MCU.ConclusionMG induced osteoblast apoptosis, possibly by regulating ROS-MCU signaling pathway.

KeywordsDiabetic periodontitis; Methylglyoxal; ROS; MCU; Apoptosis

牙周炎作為國內外常見慢性口腔疾病，其全球成人發生率已達50%[1]。目前，牙周炎與全身系統性疾病間的相互影響已經成為牙周醫學的研究熱點。其中，糖尿病作為嚴重影響人類健康的三大疾病之一，能增加牙周炎的易感性和嚴重性，影響疾病進程。牙槽骨破壞是牙周炎的重要病理特征，是造成牙齒松動和脫落的直接原因。研究揭示細胞凋亡在糖尿病性牙周炎中起著關鍵作用[2]。成骨細胞是骨代謝的中樞細胞，能夠抑制破骨細胞的形成，并分化為骨細胞形成骨網絡結構來維持機械應力，其凋亡的發生貫穿牙周炎的發生、發展，在牙周炎牙槽骨吸收中起著重要作用。甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)是糖酵解過程中一種有毒代謝產物，研究發現牙周炎患者的齦溝液中MG水平較正常者高達15～20倍，與福賽類桿菌數量呈正比[3]。此外，糖尿病患者血漿中MG濃度明顯增高，其與糖尿病以及腎病、心血管病、白內障等多種糖尿病并發癥密切相關。

糖尿病病理狀態下，體內活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)增加，抗氧化系統受抑制，氧化還原系統失衡形成氧化應激。線粒體不僅是細胞內ROS的主要來源，同時還是ROS攻擊的主要靶點。線粒體功能障礙與牙周炎細胞凋亡密切相關，活性氧自由基導致的氧化應激狀態下線粒體功能障礙誘導成骨細胞凋亡[2]。而線粒體鈣單向轉運蛋白(mitochondrial calcium uniporter，MCU)作為線粒體Ca2+的關鍵調控者，與糖尿病的發生密切相關，并且可由ROS調控誘導細胞凋亡[4]。目前，對于ROS以及MCU是否參與MG誘導成骨細胞凋亡的發生，并且在該過程中發揮怎樣的作用未見相關報道。本研究擬構建MG誘導成骨細胞凋亡模型，觀察ROS-MCU途徑在其中作用，為糖尿病牙周炎的治療奠定基礎。

材料與方法

1.材料：α-MEM細胞培養基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，甲基乙二醛、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、β-actin一抗(美國Sigma公司)，MCU一抗(美國Cell Signaling Technology公司)，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(美國Invitrogen公司)，TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)，二抗(上海碧云天生物技術有限公司)。

2.細胞培養：小鼠MC3T3-E1細胞系購自美國ATCC細胞庫，將細胞培養于含10%胎牛血清和100U/ml青霉素G和100ng/ml鏈霉素的α-MEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱，待細胞長至70%～80%融合時，用胰蛋白酶消化傳代。

3.細胞處理：對照組用α-MEM培養基培養；MG組MC3T3-E1細胞用半數抑制濃度的MG培養24h；NAC組MC3T3-E1細胞用2mmol/L NAC培養25h；NAC+MG組MC3T3-E1細胞用2mmol/L NAC預培養1h，再加入半數抑制濃度的MG培養24h。

4.細胞存活率檢測：采用MTT法進行檢測。取對數生長期的MC3T3-E1細胞，以105個/毫升的濃度接種于96孔板，培養24h后按不同分組處理后棄上清，換成無血清培養基，每孔加入20μl 5mg/ml的MTT，37℃、5%CO2培養箱避光培養4h。小心吸棄孔內上清液，每孔加入150μl DMSO，搖床上避光低速震蕩10min使結晶完全溶解，酶標儀490nm檢測吸光度值，實驗重復3次。細胞存活率(%)=(各實驗組吸光度值-調零孔吸光度值)/(對照組吸光度值-調零孔吸光度值)×100%。

5.細胞凋亡檢測：采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙標記結合流式細胞儀以及TUNEL染色法進行檢測。Annexin Ⅴ-FITC/PI法：將處理后的細胞消化收集，用預冷的結合緩沖液調整細胞密度至106個/毫升，室溫避光加入Annexin Ⅴ-FITC，再加入PI，孵育10min后流式細胞儀檢測細胞凋亡。TUNEL染色法將細胞爬片用4%多聚甲醛室溫固定1h，再用通透液(體積分數0.1% Triton X-100和質量分數0.1%檸檬酸鈉配成)2～8℃通透2min，PBS清洗后50μl反應液37℃避光孵育1h，用含有DAPI的封片劑封片，正置熒光顯微鏡觀察拍照，計數300個細胞計算凋亡率。

6.蛋白表達檢測：采用Western blot法檢測。用含有PMSF的RIPA 裂解液充分裂解細胞，超聲后高速離心機4℃ 12000r/min離心，上清液-80℃分裝保存。采用BCA法測定蛋白濃度，并將各組蛋白濃度調至相同，加入上樣緩沖液至蛋白終濃度為1μg/μl，100℃煮沸10min使蛋白充分變性。配制5%濃縮膠以及12%分離膠，每孔上樣20μg蛋白， SDS-PAGE電泳分離后濕轉法將蛋白電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，將膜分別轉入含一抗的稀釋液中(MCU 1∶2000，β-actin 1∶3000)，4℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1h，化學發光成像儀曝光，掃描圖像并用Image J 軟件分析灰度。

結 果

1.MG對成骨細胞增殖活性的影響：與對照組比較，不同濃度的MG(100、200、300、400、500、600、700、800、900μmol/L)處理24h后均能抑制成骨細胞增殖活性，并隨著MG濃度增加抑制率升高，呈濃度依賴性。MTT結果顯示，600μmol/L的MG處理細胞24h后細胞活性為50.86%，達到半數抑制率，故后續實驗采用該濃度作為給藥條件(圖1)。

圖1 不同濃度MG對成骨細胞增殖的影響與對照組比較，*P<0.05

2.MG對成骨細胞凋亡的影響：流式細胞術結果顯示，用半數抑制濃度MG處理的成骨細胞總凋亡率為39.02%，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05，圖2A、圖2B)，提示MG誘導成骨細胞凋亡。此外，在同樣的處理條件下TUNEL染色結果顯示，與對照組比較，MG處理組染色陽性率為32.48%(P<0.05，圖2C、圖2D)，顯著多于對照組，這進一步驗證了MG處理后MC3T3-E1細胞的死亡類型以凋亡為主。

圖2 MG對成骨細胞凋亡的影響A、B.流式細胞術，左上象限為壞死細胞，左下象限為正常細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞；C、D.TUNEL染色(×200)；與對照組比較，*P<0.05

3.MG對MCU蛋白表達的影響：與對照組比較，600μmol/L的MG處理MC3T3-E1細胞24h后MCU蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 MG對MCU蛋白表達的影響A.Western blot法檢測MCU蛋白表達變化；B.MCU蛋白與β-actin比較；與對照組比較，*P<0.05

4.ROS在MG誘導成骨細胞凋亡中的作用：TUNEL結果證實，NAC預處理后細胞陽性染色率較MG組顯著減少，細胞凋亡減少。此外，Western blot法檢測結果表明，與MG組比較，NAC處理后MCU蛋白表達水平減少，差異有統計學意義(P< 0.05，圖4)。

討 論

牙周炎是發生在牙支持組織的由牙菌斑中的微生物所引起的慢性感染性疾病，可導致牙周袋形成、進行性附著喪失和牙槽骨吸收，最后可致牙松動甚至脫落，是中國成人失牙的首位因素。目前，牙周炎與全身系統性疾病間的相互影響已經成為牙周醫學的研究熱點。其中，糖尿病作為嚴重影響人類健康的三大疾病之一，與牙周炎存在雙向關系，兩者發病存在共同危險因素且互為高危因素。據統計，全球已有4.25億成年人患有糖尿病，而糖尿病患者得牙周炎概率高于正常者約20%，并且牙周組織破壞更顯著以及疾病發展更迅速[5]。糖尿病病理條件下，牙周基質產生細胞如成纖維細胞以及成骨細胞凋亡增加，進一步限制了牙周軟組織和骨組織的愈合，而牙槽骨破壞是牙周炎的重要病理特征，是造成牙齒松動和脫落的直接原因[2, 6]。因此，深入研究糖尿病牙周炎中成骨細胞凋亡機制，為減少牙槽骨吸收提供理論依據，具有積極的臨床意義。

圖4 ROS在MG誘導成骨細胞凋亡中的作用A.MTT檢測細胞存活率；B、C.TUNEL染色(×200)；D、E.Western blot法檢測MCU蛋白表達變化；E.MCU蛋白與β-actin比較；與對照組比較，*P<0.05

MG屬于α-酮基醛類，由糖酵解的中間產物丙糖磷酸化裂解生成，或由丙酮和氨基丙酮代謝生成，是一種有毒的代謝產物。糖尿病高糖環境下，細胞和血漿中MG升高并長期處于較高狀態。已有研究證實MG能直接或者間接通過糖基化反應作用于細胞，誘導細胞應激反應，損傷胰島細胞降低其降糖作用，與糖尿病的進程及各項并發癥息息相關。此外，Kashket等[3]研究發現MG是牙周炎重要致病菌福賽類桿菌的產物，其濃度在牙周炎患者齦溝液中明顯高于正常者。Settem等[7]研究證實MG能誘發牙周組織的炎性反應。Retamal等[8]研究發現MG能夠誘導牙齦成纖維細胞凋亡。牙周炎患者齦溝液中MG的濃度可高達23mmol/L，本研究采用的半數抑制濃度600μmol/L遠低于該生理濃度，根據MTT結果以及流式細胞術、TUNEL凋亡染色證實，該濃度能夠誘導成骨細胞凋亡，符合既往研究結果。

近年來，ROS與糖尿病牙周炎的關系已成為研究熱點。ROS是指含氧自由基，主要是線粒體呼吸鏈電子傳遞時產生，同時，細胞本身具有復雜的抗氧化防御系統與之抗衡，當這種平衡失調ROS水平升高時，氧化應激形成。研究證實，糖尿病牙周炎患者牙周組織中ROS水平增加，并且與牙周炎附著喪失的嚴重程度呈正相關[9]。NAC作為經典的抗氧化劑，能夠清除細胞中的活性氧，其可以明顯緩解MG對成骨細胞活性的抑制，而其單獨處理對細胞并無影響。此外，糖尿病患者血清ROS增加，自身抗氧化能力下降也間接增加活性氧水平和活性氧對牙周組織的損害，而牙周基礎治療在改善牙周炎癥的同時伴隨著血清ROS的降低。線粒體作為細胞內ROS的主要來源，也是ROS攻擊的主要靶點[10]。

Sun等[2]研究發現，線粒體ROS增加、功能障礙和線粒體生理失衡是導致糖尿病牙周炎加重的發病機制。線粒體鈣單向轉運蛋白位于線粒體內膜，可順電化學梯度攝入Ca2+， 將Ca2+從胞質轉運到線粒體基質并控制轉運速率，Ca2+通過MCU進入線粒體, 激活線粒體內脫氫酶和ATP合成酶, 從而調節氧化磷酸化。已有研究證實，在構建H2O2氧化應激損傷模型中，MCU通過Ca2+超載機制，誘導HeLa細胞、小腦神經元細胞凋亡，而使用MCU阻斷劑改善了NSC34細胞系的氧化應激損傷，這說明ROS可能通過MCU誘導細胞凋亡[11，12]。此外，MCU與2型糖尿病胰島素抵抗以及糖尿病小鼠心臟功能密切相關[13，14]。Liu等[15]研究發現，MCU介導體外高糖誘導的人神經母細胞瘤細胞的凋亡，并且與ROS相關。而MCU是否介導糖尿病牙周炎中成骨細胞凋亡目前未見相關研究。本研究中，MG在誘導成骨細胞凋亡的同時伴隨著MCU蛋白表達的顯著增加，說明MCU在該過程中發揮了重要作用。為了進一步探討ROS與MCU的相關性以及在成骨細胞凋亡中的作用，本實驗采用經典抗氧化劑NAC進行干預，其能有效清除細胞內ROS，如圖4所示，MTT以及TUNEL染色結果顯示NAC不僅有效地緩解了MG對成骨細胞增殖活性的抑制，同時減少了細胞凋亡，此外，同樣的處理條件下MCU蛋白表達水平下降，而NAC單獨處理并沒有影響，這說明MG很可能是通過上調ROS水平，經MCU調控誘導成骨細胞凋亡。

綜上所述，本研究認為MG能夠誘導成骨細胞凋亡，其作用機制可能是通過激活ROS-MCU途徑來實現的，這將為進一步探索以MCU為靶點防治糖尿病性牙周炎牙槽骨吸收提供分子生物學依據。