川芎嗪對血管性癡呆(VD)大鼠和缺氧缺糖(OGD)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制

李小楠 舒剛明

ProtectiveEffectandMechanismofLigustrazineonVascularDementia(VD)RatsandOxygenGlucoseDeficiency(OGD)PC12Cells.LiXiaonan,ShuGangming.SecondMedicalDepartment,FourthMedicalCenter,GeneralHospitalofChinesePLA，Beijing100081,China

AbstractObjectiveTo study the protective effect and mechanism of Ligustrazine on vascular dementia (VD) rats and OGD-PC12 cells.MethodsThirty two male Wistar rats were randomly divided into four groups: solvent group, control group, 20mg/kg Ligustrazine group and 60mg/kg Ligustrazine group. After permanent bilateral common carotid occlusion (BCCAO), rats were given Ligustrazine for 6 weeks. At the end of the experiment, BDNF, MCP-1 and Hcy were detected by ELISA. In vitro, OGD-PC12 cells were treated with Ligustrazine for 0.5, 1, 3, 6, 12 or 24 hours. The expression of BDNF, MCP-1 and Hcy were detected by ELISA; Apoptosis was detected by AO/EB staining. The expression of cl-caspase-3, Bax and bcl-2 were detected by Western blot.ResultsCompared with the sham operation group or solvent group, the expression of MCP-1 and Hcy in other groups was significantly increased in vivo and in vitro, while the BDNF level in Ligustrazine group was lower than that in sham operation group or solvent group. The results of AO/EB staining showed that OGD-PC12 cells had serious cell damage, apoptosis played a major role in OGD, while Ligustrazine (1×10-6and 1×10-5mol/L) group had inhibitory effect on cell damage. Western blot showed that the Bax/Bcl-2 ratio and cl-caspase-3 expression in the control group increased compared with the solvent group, while Ligustrazine could reduce Bax/Bcl-2 ratio and down regulate cl-caspase-3 expression.ConclusionBy regulating Bax/Bcl-2 and down regulating cl-caspase-3 expression, ligustrazine can inhibit VD, which indicates that Ligustrazine may be a promising neuroprotective agent for VD treatment.

KeywordsLigustrazine; Vascular dementia; Bilateral common carotid artery occlusions; Brain-derived neurotrophic factor; Monocyte chemoattractant protein 1; Homocysteine

腦慢性低灌注(chronic cerebral hypoperfusion, CCH)是一種由腦血管梗死或血管狹窄所造成的疾病，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)葡萄糖和氧氣供應(yīng)不足，導(dǎo)致中樞和周圍半影的神經(jīng)元損傷，并伴有較輕的缺血損傷[1]。血管性癡呆(vasculer dementia, VD)是僅次于阿爾茨海默病(AD)的第二大癡呆類型，其特征會使患者認(rèn)知能力下降，而CCH是一個關(guān)鍵危險因素[2]。鑒于它們之間的密切關(guān)系，人們越來越關(guān)注CCH-VD的潛在機(jī)制，以提供有效的治療方法。

川芎嗪是從中草藥川芎中提取的重要活性成分之一，在中國歷史上廣泛應(yīng)用于腦卒中患者[3]。文獻(xiàn)報道，川芎嗪其衍生物通過調(diào)節(jié)炎癥、氧化應(yīng)激和NO系統(tǒng)對腦卒中后再灌注和腦出血具有保護(hù)作用[4]。然而，川芎嗪對其他神經(jīng)退行性血管相關(guān)疾病，如CCH誘導(dǎo)的血管性癡呆(VD)的神經(jīng)保護(hù)作用尚不清楚。研究表明，側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎(BCCAO)通常用來制備慢性腦低灌注動物模型，且OGD-PC12細(xì)胞模型也在CCH研究中得到了廣泛的應(yīng)用。本研究通過建立BCCAO大鼠模型以及OGD-PC12細(xì)胞模型觀察川芎嗪的作用效果，通過ELISA、AO/EB染色、Western blot法檢測對其可能機(jī)制進(jìn)行研究。

材料與方法

1.材料：BDNF、MCP-1和Hcy酶聯(lián)免疫吸附劑檢測(ELISA)試劑盒購自武漢博斯特生物工程公司；Cl-caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自貴陽凱信生物工程有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自北京中杉生物技術(shù)公司；蛋白抽提試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

2.動物及模型建立： 32只雄性Wistar大鼠(8周齡，體質(zhì)量200～220g)由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供(實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK湘：2016-0011)，并在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)1周。所有動物都可以自由獲得食物和水，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)ACU-36(20190425)。川芎嗪組大鼠在永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(BCCAO)存活后第2天接受治療，給予VD大鼠川芎嗪20或60mg/(kg·d)，灌胃6周。對照組和假手術(shù)組大鼠給予相同體積的0.9% NaCl注射液。假手術(shù)組為進(jìn)行手術(shù)但未結(jié)扎的大鼠，對照組為進(jìn)行BCCAO手術(shù)的大鼠。6周后，大鼠用乙醚麻醉，立即取海馬組織冷凍在液氮中。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：PC12細(xì)胞置于含6%胎牛血清、6%馬血清、100U/L青霉素和100U/L鏈霉素的高糖Dulbecco改良DMEM的培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第5～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)[5]方法建立OGD-PC12細(xì)胞模型，細(xì)胞與1mmol/L Na2S2O4孵育10min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，低葡萄糖DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞，用于后續(xù)研究。實(shí)驗(yàn)分為溶劑組、對照組、川芎嗪(1×10-7、1×10-6和1×10-5mol/L)組。溶劑組細(xì)胞未進(jìn)行OGD及川芎嗪處理，而對照組細(xì)胞在OGD環(huán)境中培養(yǎng)，但是不用川芎嗪處理。川芎嗪組在OGD環(huán)境中加不同濃度川芎嗪處理后培養(yǎng)。

4.ELISA法檢測BDNF、MCP-1和Hcy含量：大鼠海馬組織解凍、稱重、勻漿、離心(4000r/min)以獲得上清，并立即分裝并于-80℃中保存。根據(jù)試劑盒說明書檢測上清液中腦生物學(xué)標(biāo)志物BDNF、MCP-1和Hcy，在酶標(biāo)儀490mm處測各孔吸光度。對于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，除溶劑組和對照組外，將PC12細(xì)胞置于1×10-7、1×10-6和1×10-5mol/L川芎嗪中進(jìn)行OGD培養(yǎng)，于37℃、5%CO2中孵育0.5、1、3、6、12或24h。收集培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒說明書操作檢測BDNF、MCP-1、Hcy。

5.吖啶橙-乙醚溴化(AO/EB)染色觀察[6]：體外培養(yǎng)的OGD-PC12細(xì)胞經(jīng)1×10-7、1×10-6和1×10-5mol/L川芎嗪(溶于低葡萄糖DMEM)處理后，37℃、5% CO2中孵育0.5、3或6h。吸取培養(yǎng)上清液，用PBS洗滌細(xì)胞兩次。AO(100μg/ml)和EB(100μg/ml)以1∶1的比例預(yù)混合，然后將AO/EB溶液與PBS以1∶25的比例混合。將溶液加入培養(yǎng)板中，避光孵育1min，棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞兩次。采用熒光顯微鏡觀察川芎嗪對Na2S2O4誘導(dǎo)的OGD-PC12細(xì)胞凋亡的影響，用Image J軟件對圖片進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

6.Western blot法檢測川芎嗪對OGD-PC12細(xì)胞Bax、Bcl-2和Cl-caspase-3表達(dá)影響[7]：細(xì)胞分組處理同材料與方法5，按照蛋白提取試劑盒說明書提取細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白水平。將蛋白質(zhì)樣品以4∶1的比例與加載緩沖液混合，在95℃下煮沸5min，并以1000r/min離心2min。蛋白質(zhì)(每孔30μg)在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)移到PDVF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2h，Bax、Bcl-2、Cl-caspase-3一抗(每種抗體稀釋1∶1000)4℃孵育過夜，TBST 洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育2h，ECL顯色，用Image J軟件對靶蛋白條帶水平進(jìn)行檢測。目的基因的相對表達(dá)=目的基因灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié) 果

1.各組大鼠海馬組織中BDNF、MCP-1和Hcy含量：與假手術(shù)組比較，對照組大鼠腦組織BDNF水平降低(P<0.01)，而川芎嗪組(60mg/kg)BDNF水平高于對照組(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，對照組大鼠腦MCP-1、Hcy水平上升(P<0.01)，而川芎嗪組(60mg/kg)大鼠腦MCP-1、Hcy水平較對照組下降(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 川芎嗪對VD大鼠BDNF、MCP-1和Hcy表達(dá)的影響1.假手術(shù)組； 2.對照組； 3.川芎嗪20mg/kg組； 4.川芎嗪60mg/kg組;與假手術(shù)組比較，*P<0.01;與對照組比較，#P<0.05

2.川芎嗪對OGD-PC12細(xì)胞中BDNF、MCP-1和Hcy表達(dá)影響：對照組細(xì)胞中BDNF水平低于溶劑組(P<0.01)，并在1～12h內(nèi)迅速下降，12h后又上升，但經(jīng)川芎嗪(1×10-5mol/L)處理后BDNF水平低于對照組(P<0.01)。對照組細(xì)胞MCP-1水平從1～3h顯著升高，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時逐漸降至基礎(chǔ)水平。在1、3、6和12h對照組細(xì)胞的MCP-1水平高于溶劑組(P<0.01)，川芎嗪(1×10-6和1×10-5mol/L)組MCP-1水平較對照組降低(P<0.01)。從0.5h開始，對照組Hcy水平高于溶劑組(P<0.01)，持續(xù)升高至1h，然后逐漸下降至24h。在0.5、1和3h時發(fā)現(xiàn)川芎嗪(1×10-6和1×10-5mol/L)組Hcy水平低于對照組，但低濃度川芎嗪(1×10-7mol/L)組BDNF、MCP-1水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖2。

圖2 OGD-PC12細(xì)胞中BDNF、MCP-1和Hcy表達(dá)與溶劑組比較，*P<0.01；與對照組比較，#P<0.05，##P<0.05

3.AO/EB染色觀察川芎嗪對OGD-PC12細(xì)胞凋亡影響：與溶劑組比較，0.5h后對照組出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞腫脹，細(xì)胞發(fā)生凋亡甚至壞死。0.5～6h時，川芎嗪(1×10-6和1×10-5mol/L)組對細(xì)胞損傷有明顯的抑制作用，凋亡和壞死較對照組減輕，而川芎嗪(1×10-7mol/L)組凋亡和壞死與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖3。

4.川芎嗪對OGD-PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白影響：對照組Bax/Bcl-2和Cl-caspase-3表達(dá)高于溶劑組(P<0.05)，經(jīng)不同濃度川芎嗪處理后Cl-caspase-3表達(dá)低于對照組(P<0.01)，且呈濃度依賴性。與對照組比較，川芎嗪(1×10-5mol/L)組Bax/Bcl-2下降(P<0.05)，詳見圖4。

討 論

腦慢性低灌注(chronic cerebral hypoperfusion, CCH)可以導(dǎo)致腦缺血缺氧，與老年相關(guān)疾病如阿爾茲海默病(Alzheimer′s disease, AD)及血管性癡呆(vascular-dementia，VD)等多種疾病相關(guān)[8, 9]。目前對血管性癡呆的機(jī)制研究仍然存在許多困難，主要集中在單一途徑上，且不夠詳細(xì)[10, 11]。

圖3 川芎嗪對OGD-PC12細(xì)胞凋亡的影響(AO/EB染色，×400)藍(lán)色箭頭.凋亡細(xì)胞;紅色箭頭.壞死細(xì)胞與溶劑組比較，*P<0.01；與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01

川芎嗪是從一種著名的中藥，已廣泛應(yīng)用于腦低灌注相關(guān)疾病，如腦卒中和阿爾茨海默病患者[12]。本研究建立BCCAO大鼠和OGD-PC12細(xì)胞模型，觀察血管性癡呆(VD)大鼠潛在的神經(jīng)病理改變及川芎嗪的保護(hù)作用。由于其慢性臨界低灌注環(huán)境，筆者進(jìn)行了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，選取了多個具有代表性的促凋亡和抗凋亡生物學(xué)標(biāo)志物，檢測BCCAO大鼠海馬和OGD-PC12細(xì)胞中BDNF、MCP-1和Hcy等表達(dá)，從不同途徑對川芎嗪對VD神經(jīng)元損傷的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了較為清晰的研究。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神經(jīng)元生長、存活的必需因子，腦缺血后檢測BDNF水平可以作為抗凋亡因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)功能指標(biāo)[13]。單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)水平進(jìn)行測定，以評估促凋亡和炎癥狀態(tài)，而同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是腦內(nèi)促凋亡和氧化應(yīng)激的標(biāo)志物[14～17]。體內(nèi)和體外ELISA檢測結(jié)果表明，對照組MCP-1和Hcy水平明顯高于假手術(shù)組和溶劑組，但經(jīng)川芎嗪治療后BDNF在神經(jīng)元損傷中的減少，與其他生物學(xué)標(biāo)志物比較，BDNF的趨勢相反，這說明發(fā)生腦灌注不足時會抑制神經(jīng)元生長因子表達(dá)以及激活炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且可能在以后的VD發(fā)病過程中繼續(xù)存在。而川芎嗪能通過降低MCP-1和Hcy水平，同時升高BDNF水平，抑制損傷級聯(lián)反應(yīng)，抑制促凋亡表達(dá)。

圖4 川芎嗪對OGD-PC12細(xì)胞Bax、Bcl-2和Cl-caspase-3表達(dá)影響1.溶劑組；2.對照組；3.川芎嗪 1×10-7mol/L組；4.川芎嗪 1×10-6mol/L組；4.川芎嗪 1×10-5mol/L組；與溶劑組比較，*P<0.01；與對照組比較，#P<0.05,##P<0.05

為進(jìn)一步探討川芎嗪對CCH向VD發(fā)展的預(yù)防作用，AO/EB染色觀察發(fā)現(xiàn)，與溶劑組比較，0.5h后對照組出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞腫脹，細(xì)胞發(fā)生凋亡甚至壞死，而當(dāng)0.5～6h時，川芎嗪(1×10-6和1×10-5mol/L)組對細(xì)胞損傷有明顯的抑制作用，凋亡和壞死較對照組減輕，且呈濃度依賴性。這說明在低氧和低葡萄糖環(huán)境下，神經(jīng)元功能受損，部分結(jié)構(gòu)崩潰并解體，同時在死亡過程中發(fā)生凋亡和壞死。但在這些實(shí)驗(yàn)中，川芎嗪隨著濃度的增加顯著降低了PC12細(xì)胞凋亡和死亡細(xì)胞數(shù)，具有明顯保護(hù)作用。

相關(guān)研究顯示，細(xì)胞凋亡在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著重要作用，如阿爾茨海默病和帕金森病[18～20]。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)節(jié)，Bcl-2家族中發(fā)現(xiàn)與凋亡關(guān)系密切的基因是Bcl-2和Bax，一般認(rèn)為Bcl-2抑制凋亡、Bax主要誘導(dǎo)凋亡，二者互相調(diào)節(jié)，Bcl-2和Bax的比例決定細(xì)胞凋亡的趨勢；caspase-3是凋亡過程中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，細(xì)胞凋亡產(chǎn)生信號傳遞至caspase-3，并使其開始活化，以蛋白底物裂解、細(xì)胞解體為結(jié)局。Western blot法檢測結(jié)果顯示，OGD-PC12細(xì)胞中Cl-caspase-3表達(dá)及Bax/Bcl-2比值均高于溶劑組，說明CCH-VD過程中上調(diào)線粒體相關(guān)的Bax/Bcl-2和Cl-caspase-3信號通路會發(fā)生嚴(yán)重的凋亡，而川芎嗪治療后Cl-caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降，且川芎嗪還對凋亡蛋白表達(dá)具有劑量依賴性抑制作用。值得注意的是，對于川芎嗪(1×10-6和1×10-5mol/L)組，上述結(jié)果可能還與VD病程中BDNF、MCP-1、Hcy的平衡及綜合作用有關(guān)。一方面，BDNF具有抗炎和抗氧化作用，對MCP-1和Hcy表達(dá)產(chǎn)生影響，但BDNF在神經(jīng)元凋亡中表達(dá)受到抑制；另一方面，MCP-1和Hcy的上調(diào)促進(jìn)了神經(jīng)元凋亡，間接導(dǎo)致BDNF表達(dá)下調(diào)。

綜上所述，川芎嗪通過降低Bax/Bcl-2比值和Cl-caspase-3的表達(dá)抑制線粒體凋亡途徑，這些發(fā)現(xiàn)為VD疾病的治療提供了一個新的視角，同時也表明川芎嗪是一種很有前途的神經(jīng)保護(hù)劑，對其他神經(jīng)退行性血管疾病可能具有保護(hù)作用。