辛伐他汀聯合雌二醇對去卵巢大鼠骨質疏松的影響

李澤清 丁軍穩 任榮 丁啟龍 王哲 米濤 陸川 李釗偉 *

1. 青海大學附屬醫院，青海 西寧 810000 2. 青海省湟中縣第二人民醫院，青海 西寧 811601

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量(骨礦物質和骨基質)減少、骨組織顯微結構退化(骨小梁結構破壞、變細和斷裂)，骨生物力學改變(骨力學強度下降、骨載荷承受力降低、骨脆性增高)和骨折危險性增加為特征的全身代謝性骨病[1]。隨著全社會人口的老齡化，OP的發病率逐年上升，OP已成為老年人的一種常見病、多發病，其常常合并嚴重并發癥(如骨折)，且預后較差，給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔[2]。目前防治OP的藥物主要分為4類：①促進骨礦化藥物；②促進骨形成藥物；③抑制骨吸收藥物；④解偶聯劑。雌激素水平降低是OP的重要誘因之一，雌激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)是目前防治OP的有效措施[3]。近年來研究表明辛伐他汀具有激活成骨細胞、促進骨合成代謝和骨形成作用，這一特性為進一步尋找防治OP藥物指明了新方向和新思路[4]。本研究試圖觀察辛伐他汀、雌二醇聯合干預對大鼠骨質疏松的影響，旨在為OP的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級雌性SD大鼠75只，3月齡，體重320～350 g，由青海大學醫學院動物實驗中心提供，辛伐他汀(舒降之)：40 mg/片，生產批號：1810261，美國默沙東公司；苯甲酸雌二醇：100 μg/支，生產批號：1708072，浙江仙居制藥廠。EXPERT型雙能X線骨密度測定儀購于美國LUNAR公司，MTS-858型骨生物力學實驗機購于美國MA公司，堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)、I型前膠原羧基端前肽(PICP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)檢測試劑盒購于美國R&D公司。

1.2 方法

1.2.1實驗分組及處理：75只雌性SD大鼠按隨機數字法分組；假手術組、去勢組、辛伐他汀組、雌二醇組、聯合藥物組。假手術組僅切除部分脂肪組織，其他4組均行雙側卵巢切除術。造模成功后于第2天給予同藥物處理，辛伐他汀用0.9%Nacl配制1 mg/mL混懸液，假手術組、去勢組：皮下注射等量0.9% Nacl，1次/d；辛伐他汀組：辛伐他汀[4 mg/(kg·d)，灌胃，1次/d]；雌二醇組：苯甲酸雌二醇(1 mg，肌肉注射，1次/d)；聯合用藥組：辛伐他汀[4 mg/(kg·d)，灌胃，1次/d]+苯甲酸雌二醇(1 mg，肌肉注射，1次/d)，連續用藥6周。

1.2.2去卵巢骨質疏松大鼠模型：2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，備皮消毒，取腹背部中線第2腰椎水平做長約2 cm雙背側縱行切口，依次分離進入腹腔，尋找卵巢組織，平鑷將卵巢牽出，嚴密結扎輸卵管及其周圍血管、脂肪組織，完整切除雙側卵巢，假手術組僅切除卵巢周圍等量脂肪組織，不予切除卵巢和結扎輸卵管，沖洗傷口，止血徹底，逐層縫合，關閉腹腔，術后立即注射青霉素20萬U預防感染。

1.2.3標本取材與處理：藥物干預6周，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，采用快速心臟急性大失血法處死大鼠，取血8～10 mL，高速冷凍離心，3 000 r/min×10 min，EP管收集上層血清1～2 mL，-20 ℃保存備用。逐層剝離L4腰椎和雙側股骨，剔除周圍軟組織，以無菌生理鹽水濕紗布包裹，置于-20 ℃保存備用。另留取椎體10%甲醛溶液固定，10% EDTA 6周，乙醇脫水，二甲苯透明，制備石蠟切片，60 ℃烤箱4 h，保存備用。

1.2.4骨代謝相關生化指標檢測：取出上清液，采用ELISA試劑盒檢測血清中ALP、BGP、PICP、TRAP，按試劑盒說明書步驟操作。

1.2.5骨組織骨密度(bone mineral density，BMD)和礦物含量(bone mineral content，BMC)測定：取出待測大鼠L4腰椎和右股骨，在LUNAR雙能X線吸收掃描儀掃測，采用小物體Discovery Wi掃描模式：掃描類型hHi-Res、掃描精度1%、掃描速度60 mm/s、掃描寬度5.0 cm、分辨率1.0 mm×1.0 mm等參數值，用儀器選定興趣區，以2.0 mm×2.0 mm為中心區域，應用小動物軟件分析計算BMD和BMC值。

1.2.6骨生物力學指標檢測：取出腰5椎體和右側股骨，游標卡尺測量椎體和股骨長度，將置于電子萬能生物力學材料試驗機進行三點彎曲力學試驗，固定骨標本位置，保持標本上下面水平，支點跨距20 mm，最大量程1 000 N，加載速度1 mm/min，計算機記錄儀記錄載荷-變形曲線，計算最大載荷、最大應力、最大位移和結構剛度。

1.2.7HE染色：取出石蠟切片，脫蠟，水化，流水沖洗，蘇木精染色10 min，流水沖洗，0.5%鹽酸酒精分化10 s，流水沖洗30 min，返藍，蒸餾水洗滌3～5 s；伊紅染色2～3 min，流水沖洗；再次脫水，透明；封片，光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 骨代謝相關生化指標

去勢組血清ALP、BGP、PICP、TRAP水平較假手術組顯著增高(P<0.05)，辛伐他汀組、雌二醇組、聯合藥物組血清ALP、BGP、PICP、TRAP水平較去勢組均降低，其中尤以聯合用藥組降低最顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清骨代謝指標比較Table 1 Comparison of serum bone metabolism markers among the groups

2.2 骨組織BMD和BMC

去勢組腰椎和股骨BMD和BMC較假手術組顯著降低(P<0.05)，辛伐他汀組、雌二醇組、聯合藥物組較去勢組腰椎(L4)和股骨BMD和BMC均增高，其中以聯合藥物組增高最顯著(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腰椎和股骨BMD和BMC比較Table 2 Comparison of BMD and BMC in lumbar spine and femur among the groups

2.3 骨生物力學指標

去勢組股骨最大載荷、最大應力、最大位移和剛度較假手術組均顯著降低(P<0.05)，辛伐他汀組、雌二醇組、聯合藥物組較去勢組股骨最大載荷、最大應力、最大位移和剛度均顯著增高，其中以聯合用藥組增高最顯著(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠股骨生物力學指標比較Table 3 Comparison of biomechanical indexes of femur among the groups

2.4 骨組織形態學

假手術組腰椎骨組織結構完整，骨小梁密集，粗細適中，排列整齊，連接成網狀，脂肪細胞少。去勢組骨組織呈骨質疏松特征性表現，骨小梁明顯減少，稀疏，游離端多，排列紊亂，網狀結構破壞，大量纖維組織，髓腔內大量空泡狀脂肪細胞。辛伐他汀組和雌二醇組骨小梁數量增多，排列尚規則，網狀結構略微修復，結構仍不完整，脂肪細胞變少。聯合藥物組骨組織結構較完整，骨小梁數目明顯增多，致密均勻粗壯，連接成網狀結構，脂肪細胞明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠HE染色觀察骨組織的形態結構變化(×200) A：假手術組；B：去勢組；C：辛伐他汀組；D：雌二醇組；E：聯合藥物組。Fig.1 Morphological changes of bone tissue observed with HE staining (×200) A：Sham operation group；B：Castration group；C：Simvastatin group；D：Estradiol group；E：Combination drug group.

3 討論

隨著我國人口老齡化進程的加劇，21世紀中葉將步入老年高峰期，OP嚴重危害中老年人群的健康和生活質量，對公共衛生造成嚴重危害。目前治療臨床防治OP藥物種類繁多，作用特點不同，但單藥在療效、副作用和安全性等方面存在很多問題，治療效果皆不夠理想[5]。因此，進一步尋找抗骨質疏松的聯合藥物干預對防治OP有重大意義。

雌激素水平下降是老年骨質疏松的主要誘因。雌激素匱乏可打破成骨與破骨效應平衡環境，成骨和破骨比例失衡，骨形成減少，骨吸收增強，骨量丟失，引發骨質疏松[6]。雌激素是目前臨床應用防治OP的主要藥物，HRT治療OP的目的是用雌激素進行生理性補充，發揮其最大臨床效應[7]。雌激素的抗骨質疏松作用主要是通過直接結合破骨細胞表面受體，抑制破骨細胞生長、分化，延緩骨量減少進程，抑制骨吸收；又可直接結合成骨細胞表面受體，調節成骨代謝，誘導促進骨形成骨重建等[8]。

辛伐他汀是目前臨床常用于降低膽固醇、預防心血管疾病的藥物，屬于3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑。其通過增加骨密度，恢復骨微結構，抑制骨吸收，促進骨形成等，起到抗骨質疏松作用[9]。辛伐他汀既能促進骨形成，又抑制骨吸收，它通過多種路徑發揮抗骨質疏松的作用：①抑制HMG-CoA還原酶活性，誘導骨形成蛋白-2(BMP-2)基因表達，誘導成骨細胞分化，骨基質形成及基質的礦化過程，促進新骨形成[10]；②抑制骨髓間充質干細胞(BMSCs)的成脂分化，誘導其轉化為成骨細胞，促進骨形成；③激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，促進成骨細胞增殖和堿性磷酸酶(ALP)合成，誘導成骨細胞分化，促進骨形成[11]；④激活Ras/MAPK途徑，抑制白細胞介素-6(IL-6)表達，從而抑制骨吸收；⑤通過抑制HMG-CoA還原酶，減少甲羥戊酸(MVA)的合成，減少破骨細胞數量，抑制破骨細胞作用，抗骨吸收[12]。

本研究證實辛伐他汀聯合雌二醇干預對大鼠骨質疏松起到很好的防治作用，辛伐他汀聯合雌二醇可通過調節去勢骨質疏松性大鼠骨代謝，增加骨密度和骨礦物質，改善骨生物力學和骨組織微結構，起到抗骨質疏松療效及骨保護作用。他汀類和雌激素類藥物可能通過復雜的信號通路誘導BMP-2表達，促進成骨細胞增殖分化，促進新骨形成，從而發揮抗OP作用[13]。馬慶芬等[14]研究說明雌激素和辛伐他汀序貫療法可以增加骨密度、提高骨鈣素、降低IL-6，通過抑制骨吸收，促進骨形成有效地治療骨質疏松。王春先等[15]研究表明辛伐他汀和雌激素聯合應用可增加成骨細胞堿性磷酸酶活性，提高細胞的礦化能力，對成骨細胞的分化和成熟有協同作用。張麗彥等[16]研究表明雌激素與辛伐他汀序貫療法可有效促進骨質疏松大鼠骨形成，促進骨愈合。

綜上所述，他汀類和雌激素類藥物聯合干預抗大鼠骨質疏松作用較單藥作用更佳，這可能與兩藥的協同作用機制有關。但目前仍有許多問題急需解決，如提高他汀類的生物利用度、尋找最優給藥劑量、給藥方式以及降低長期使用雌激素不良反應。本研究的結果給后續研究留下了廣闊的空間，可能還有許多不為人知的作用機制，尚有待于進一步深入研究。相信隨著上述問題的解決，辛伐他汀和雌激素的應用空間將更加廣闊。