金匱腎氣丸調控β-catenin 通路治療去卵巢小鼠骨質疏松

陳一洲 葉勇健 李之斌 陳丹琦

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一類以骨量流失，骨微結構異常導致骨骼脆性增加的代謝性疾病。中醫認為，PMOP 屬于“骨萎”范疇，其根本病機為“腎虛”。金匱腎氣丸作為溫補腎陽的經典代表方[1]，廣泛應用于PMOP 患者的治療，取得一定的臨床療效。經典Wnt/β-catenin 信號通路在骨穩態平衡中發揮重要作用，其缺失或過度活化會導致骨量的驟降或激增[2-3]，是治療PMOP 重要的分子靶點[4]。本實驗通過金匱腎氣丸干預去勢骨質疏松小鼠模型，驗證金匱腎氣丸防治PMOP 的療效，進一步探討其對β-catenin 信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動 物 雌性10 周齡C57BL/6 小鼠24 只，體質量（20±2）g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供[生產許可證號：SCXK（浙）2019-0008；使用許可證號：SYXK（浙）2019-0015]。小鼠飼養在濕度（40±5）%、溫度（23±2）℃，晝夜12h 更替的環境下，可自由飲水和進食。本研究經浙江省寧波市鄞州區第二醫院倫理委員會審核[審批號：（2019）倫審（31）號]。

1.2 藥物及試劑 戊巴比妥粉（中生瑞泰科技有限公司，批號921019），青霉素（規格：80 萬單位，山東魯抗醫藥股份有限公司，批號10121909073），4%多聚甲醛（Solarbio 公司，批號P1110），Alcian blue/hematoxylon（ABH）染液（Sigma 公司，美國，批號17372-87-1），Orange G 染液（Sigma 公司，美國，批號1936-15-8），核酸檢測試劑盒（Takara 公司，日本，批號9534），金匱腎氣丸（規格：72g/瓶，北京同仁堂，批號Z11020147）。

1.3 主要儀器 蔡司顯微鏡（Zeiss 公司，德國），Micro-CT（Skyscan 1170，Bruker 公司，比利時），骨形態計量儀（Osteometrics 公司，美國），熒光定量PCR儀（Termor 公司，美國）。

1.4 小鼠造模及分組 按照隨機數字表法，將小鼠分成假手術組、模型組和金匱腎氣丸組，每組8 只。造模方法：腹腔注射0.3%戊巴比妥（0.1mL/10g）麻醉后，常規皮膚剃毛消毒，于背部正中線作長約1.5cm的切口，沿背部肋弓緣、腰椎旁逐層進入腹腔，暴露兩側卵巢及輸卵管。其中模型組和金匱腎氣丸組摘除雙側卵巢及結扎輸卵管；假手術組8 只，摘除雙側卵巢周圍等量脂肪組織。檢查無活動性出血，逐層縫合傷口。術后連續3 天腹腔注射青霉素（每次6 萬，每天1 次）預防感染。

1.5 藥物干預 術后觀察3 天，所有小鼠均未出現切口感染或死亡，第4 天起開始藥物干預。根據實驗小鼠與成人的體表面積比例進行劑量換算[5]，每只小鼠（體質量按20g 計算）灌胃劑量為0.2mL/天。金匱腎氣丸組小鼠予金匱腎氣丸溶液（72g 腎氣丸加熱溶于100mL 蒸餾水中，繼續加熱濃縮至含生藥1g/mL）0.2mL/天連續灌胃8 周。模型組小鼠給予等體積0.9%生理鹽水灌胃，假手術組小鼠不作處理。

表1 小鼠Micro-CT 骨微結構參數比較（）

表1 小鼠Micro-CT 骨微結構參數比較（）

注：假手術組予切除等量脂肪組織；模型組予切除雙側卵巢；金匱腎氣丸組予切除雙側卵巢+金匱腎氣丸灌胃；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

1.6 Micro-CT 掃描分析 造模8 周后，摘取小鼠左側股骨，剔除周圍軟組織，置于Micro-CT 進行掃描檢測。掃描參數為：分辨率4000×2672，鋁板0.2μm，掃描層厚為10μm。骨微結構重點分析股骨干骺端松質骨的區域，具體檢測參數為：骨密度、骨體積分數、骨小梁數目、骨小梁間距和骨小梁厚度。

1.7 樣本制作 Micro-CT 掃描完成后，將股骨組織置于4%多聚甲醛中固定48h，隨后進行脫鈣、脫水及石蠟包埋處理，制作成3μm 厚度的石蠟切片。

1.8 特殊染色及定量分析 完成脫蠟復水后，將切片置于ABH 染液染色1h。0.3%鹽酸酒精分化、1%氨水返藍后，置于Orange G 染液浸洗1min。純水清洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，透明樹脂封片。使用骨形態計量儀對染色后的切片進行組織形態定量分析，包括骨小梁面積分數（%）、脂肪空泡面積比（%）和脂肪空泡直徑（μm）。

1.9 聚合酶鏈式反應（qRT-PCR） 摘取小鼠右側股骨，剔除周圍軟組織，PBS 清洗3 遍后，按照核酸檢測試劑盒進行熒光定量PCR 檢測β-catenin、鋅指結構轉錄因子（Osterix），堿性磷酸酶（ALP）mRNA 表達情況。

2 結果

2.1 金匱腎氣丸延緩PMOP 小鼠骨量流失 Micro-CT 檢測分析顯示，與假手術組比較，去卵巢后模型組小鼠股骨骨密度下降，骨結構破壞，骨小梁數量減少，間距增大（P 均＜0.05），提示去卵巢PMOP 小鼠模型建立成功；與模型組比較，金匱腎氣丸組小鼠骨密度、骨體積分數、骨小梁數目和骨小梁間距均顯著改善（P 均＜0.05）。見表1。

2.2 金匱腎氣丸改善PMOP 小鼠股骨遠端骨髓腔結構 小鼠骨組織經ABH 染色后，骨小梁呈橘色，骨髓細胞呈紫色和脂肪空泡呈白色圓形。ABH 染色及骨組織形態計量分析結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠骨小梁結構稀疏，髓腔內骨髓細胞排列紊亂，出現大量脂肪空泡。骨面積分數減少，脂肪空泡面積比和直徑變大（P 均＜0.05）；金匱腎氣丸治療后，小鼠股骨骨小梁明顯增粗，髓腔內骨髓細胞數量增多且排列有序。骨面積分數增加，脂肪空泡面積及直徑顯著減小（P 均＜0.05）。見圖1，表2。

圖1 小鼠股骨病理（ABH 染色×100 倍）

表2 小鼠骨組織形態定量分析（）

表2 小鼠骨組織形態定量分析（）

注：假手術組予切除等量脂肪組織；模型組予切除雙側卵巢；金匱腎氣丸組予切除雙側卵巢+金匱腎氣丸灌胃；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

2.3 金匱腎氣丸促進β-catenin 及其下游成骨基因表達 mRNA 定量檢測分析結果顯示，與假手術組比較，模型組β-catenin 及下游的成骨基因Osterix和ALP 表達顯著下降（P 均＜0.05）；與模型組比較，金匱腎氣丸干預8 周后，β-catenin、Osterix 和ALP的mRNA 表達明顯改善（P 均＜0.05），見表3。

表3 β-catenin、Osterix 及ALP mRNA 定量分析（IOD/Area，）

表3 β-catenin、Osterix 及ALP mRNA 定量分析（IOD/Area，）

注：假手術組予切除等量脂肪組織；模型組予切除雙側卵巢；金匱腎氣丸組予切除雙側卵巢+金匱腎氣丸灌胃；β-catenin 為β 連環蛋白；Osterix 為結構轉錄因子；ALP 為堿性磷酸酶；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

3 討論

PMOP 是一類與干細胞分化異常相關的骨代謝性疾病[6-7]。干細胞具有自我更新及持續成骨分化的能力，在機體骨穩態維持中起關鍵作用。干細胞表面表達有雌激素受體，與雌激素特異性結合后，能促進干細胞向成骨細胞分化，抑制其成脂肪分化[8]。女性絕經后，雌激素水平下降，導致干細胞成骨-成脂分化異常，是PMOP 重要的細胞學發病機制。

根據中醫“腎藏精主骨”理論，中醫治療PMOP重在“補腎”。《醫經精義》指出，“腎藏精，精生髓，髓養骨，故骨者，腎之合也”。現代研究發現，“腎藏精主骨”的科學內涵主要體現在通過補腎來調控干細胞的增殖分化狀態，進而影響骨量和骨微結構[9-10]。金匱腎氣丸是“補腎”的經典方劑，其干預PMOP 可能是通過調控干細胞的分化實現的。

β-catenin 作為一個肌肉骨骼分子調控開關，能夠決定干細胞分化方向。經典Wnt 信號通路中，Wnt配體與細胞膜表面受體Frizzled 和LRP5/6 相結合，募集Disheveled 和Axin，破壞了穩定的四聚體結構，導致胞漿內β-catenin 堆積，經跨核膜轉激活下游成骨靶基因表達[11]。轉基因動物研究表明，β-catenin基因缺失會導致骨形成及骨礦化能力下降，出現嚴重的骨質疏松表型[12]。由此提示，β-catenin 是治療骨質疏松癥潛在的分子靶點。

本研究結果顯示，模型組小鼠骨量較假手術組顯著下降，骨微結構破壞明顯，提示PMOP 小鼠模型成功建立。金匱腎氣丸干預8 周后，PMOP 小鼠骨量丟失減少，證明金匱腎氣丸能夠有效防治去勢小鼠PMOP 的發生。病理上，造模組小鼠骨小梁稀疏，髓腔內脂肪空泡堆積；金匱腎氣丸治療后，脂肪空泡數量顯著減少，并且代替以正常的骨髓細胞及骨小梁，提示去勢造模后，小鼠骨內存在干細胞成骨-成脂分化異常，而金匱腎氣丸能夠調控干細胞向成骨細胞分化，從而改善小鼠骨量丟失。Osterix 和ALP 是經典Wnt/β-catenin 信號通路下游的成骨靶基因。Osterix是MSCs 成骨分化的特異性轉錄調節因子，ALP 具有促進羥磷灰石沉積，能夠反映成骨形成能力。qRTPCR 結果顯示，去勢造模后，小鼠股骨β-catenin 及下游Osterix 和ALP 的mRNA 表達明顯減少，可能導致干細胞成骨分化減弱。金匱腎氣丸能夠激活βcatenin 信號通路，促進下游的Osterix 和ALP 靶基因的表達，影響MSCs 成骨-成脂分化，延緩去勢小鼠骨量流失和骨微結構破壞。

綜上所述，金匱腎氣丸可能通過激活β-catenin信號通路及下游Osterix、ALP 成骨基因表達，進而調控干細胞成骨分化，防治去勢小鼠骨質疏松。