水飛薊賓通過PI3K/AKT/FoxO1通路改善骨質疏松大鼠骨代謝和骨量

付濤 吳曉東 阿力·艾拜

新疆生產建設兵團醫院關節脊柱科，新疆 烏魯木齊 830002

骨質疏松是一種以骨量減少、骨微結構受損、骨脆性增加、骨折風險增加為特征的代謝性骨病。據估計，在全世界老年婦女中，與骨質疏松有關的骨折發病率約為40 %，在男子中約為13 %[1]。糖皮質激素由于其抗炎和免疫抑制作用，在臨床上得到了廣泛的應用。激素治療期間骨保護素與核因子受體激活劑κB配體比值的變化導致前3～6個月骨吸收增加，出現骨質疏松的不良反應，骨折風險也明顯增加[2]。糖皮質激素引起的骨質疏松(GIOP)在繼發性骨質疏松中居首位。有一些證據顯示氧化應激與絕經后骨密度喪失之間的相關性；絕經期雌激素缺乏會增加氧化應激和骨量流失[3]。水飛薊素(Silibinin, SIL)是一種抗氧化劑，具有保肝、抗癌、神經保護和心臟保護作用[4]。此外，據報道，水飛薊賓通過抑制鼠MC3T3-E1中的破骨細胞生成并增強成骨細胞的生成，有可能在體外預防骨量丟失[5]。此外，有研究發現水飛薊賓可通過刺激骨髓干細胞(hBMSCs)中堿性磷酸酶、I型膠原和骨鈣素表達的成骨生物標志物來增強成骨作用[4]。由于氧化應激在OP中發揮重要作用，水飛薊素具有抗氧化作用，然而，其對GIOP的研究目前有限。因此，本研究旨在探討水飛薊素對GIOP大鼠骨量和骨代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

12周齡雌性Sprague Dawley(SD)大鼠30只，體質量(230±15)g，購自上海實驗動物中心。水飛薊素[Silymarin capsules (Ligalong)，批號： 20190021]、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、Ⅰ型膠原交聯羧基末端肽(CTX-I)、堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒和骨鈣素(OC)酶聯免疫吸附分析(ELISA)試劑盒購自中國上海源業生物技術有限公司。

1.2 實驗分組和治療

動物分組造模，自適應喂養雄性SD大鼠1周，測定空腹血糖(FBG)。將大鼠隨機分為3組，每組10只：對照組(CON組)，肌肉注射生理鹽水0.1 mL；地塞米松組(DEX組)10只，肌肉注射地塞米松溶液0.1 mL，1 mg/kg(每周2次)；連續干預3個月建立GIOP大鼠模型[6]。地塞米松+水飛薊素組(SIL組)10例，給予地塞米松溶液0.1 mL，每周2次；同時給予水飛薊素100 mg/(d·kg)灌胃，直至實驗結束。處死前集外周血清和雙側股骨。雙側股骨用生理鹽水紗布包裹，置于-20 ℃的冰箱中備用。

1.3 檢測指標

將左側股骨在室溫下解凍并固定在樣品架中，使用SCANCOuCT80進行微計算機斷層掃描(micro computed tomography，Micro-CT)掃描。該掃描儀的電壓為50 kVp，電流為200 μA，分辨率為15 μm/像素。骨微結構參數包括骨密度(BMD)、組織骨密度(TMD)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨體積/總體積(BV/TV)、相對骨表面(BS/TV)、骨小梁分離度(TBsp)和連接密度(Conn.D)，通過使用內置軟件進行定量分析來確定連接密度(connection density，Conn.D)。

待影像學檢測完畢后，進行三點彎曲實驗。在進行測試時，股骨水平放置在機器的表面上，探頭慢慢地放下。加載方向垂直于實驗臺，作用在骨的中心軸上，加載速度為2 mm/min。通過與試驗機連接的計算機專用軟件自動記錄載荷-位移曲線，得到最大載荷和彈性模量。

使用試劑盒檢測大鼠血清TRACP、CTX-I、ALP和OC水平，并嚴格按照生產廠家試劑盒上的說明進行操作。ELISA試劑盒檢測血清TRACP、CTX-I、ALP和OC水平。

隨后對大鼠股骨進行蛋白印跡分析。取自右側股骨的骨標本放入RIPA緩沖液中溶解。在4℃下以12 000 r/min離心20 min后收集上清液，并用改進的Bradford法(Bio-Rad Laboratory Inc.，Hercules，CA，USA)測量蛋白質濃度。裂解物(20～30 g)用10 %十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并轉移到硝酸纖維素印跡膜上。在室溫下用5 %脫脂牛奶(用牛血清白蛋白檢測磷酸化蛋白)封閉1 h后，用抗β-肌動蛋白(1∶5 000；ab6276)、抗akt(1∶500；ab28422)、抗p-akt(1∶500；ab8932)、抗foxO1(1∶1 000；ab52857)孵育膜和抗p-FoxO1(1∶500；ab131339)抗體(均來自英國劍橋的Abcam)在4 ℃過夜，然后與二抗(1∶1 000；Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA，USA)在37 ℃孵育1 h。用Image J軟件測量各蛋白條帶的總和密度。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠體重比較

治療12周后，大鼠的體重發生變化，DEX組大鼠體重明顯低于CON組(P<0.05)；而SIL組與CON組相比，體重無顯著變化(P>0.05)，見表1。其中CON組2只大鼠死亡，而SIL組與DEX組各有3只大鼠死亡。

表1 大鼠的體重變化Table 1 The changes of body weight of

2.2 Micro-CT分析結果

股骨干骺端三維重建結果如圖1所示。股骨的微觀參數如表2所示。DEX組左側股骨BMD、TMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th、Tb.p、BS/TV較對照組明顯下降(P<0.05)；SIL組左側股骨BMD、Conn.D、Tb.Th均明顯高于DEX組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠治療12周后左股骨干骺端三維重建結果Fig.1 Three-dimensional reconstruction of the left femoral metaphysis after 12 weeks of treatment in each group of rats

表2 大鼠左股骨的Micro-CT檢測結果Table 2 Micro-CT results of the left femur of

2.3 股骨的生物力學變化

股骨三點彎曲試驗表明，SIL組的最大載荷和彈性模量均高于DEX組，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 右股骨的三點彎曲試驗結果Table 3 Three-point bending test results of the right femur of

2.4 血清ALP、OCTRACP和CTX-I的變化

與CON組比較，DEX組血清骨形成指標(ALP、OC)顯著降低(P<0.05)，骨吸收指標TRACP、CTX-I顯著升高(P<0.05)。與DEX組比較，SIL組血清骨形成指標ALP和OC顯著升高(P<0.05)，骨吸收指標TRACP和CTX-I顯著降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 大鼠的ALP，CTX-1，OC和ACP的結果Table 4 Results of ALP, CTX-I, OC, and ACP of

2.5 SIL對PI3K/AKT/FoxO1信號通路影響

通過蛋白質印跡檢測AKT、磷酸化的AKT(p-AKT)、FoxO1和p-FoxO1水平。與CON組相比，地塞米松提高了p-AKT/AKT的比例和p-FoxO1的蛋白質含量，但FoxO1的蛋白質水平卻有降低(P<0.05和P<0.01)(圖2)。根據這些結果，地塞米松抑制了FoxO1的轉錄活性。用大蒜素處理后，部分消除了地塞米松的上述作用(P<0.05和P<0.01)。這些數據表明，大蒜素通過抑制PI3K/AKT信號通路能夠上調FoxO1轉錄活性。總的來說大蒜素上調FoxO1轉錄活性調控骨代謝。

圖2 SIL促進FoxO1蛋白質表達注：A 通過蛋白質印跡分析確定p-AKT、AKT、p-FoxO1和FoxO1的蛋白質水平；B 和DEX組相比，SIL組顯著降低組織中p-AKT/AKT的比率。與CON組比較，**P<0.01；與DEX組比較，##P<0.01。Fig.2 FoxO1 protein expression promoted by SIL

3 討論

在本研究中，使用Micro-CT發現DEX組大鼠股骨的骨密度顯著下降，表明建模是成功的。用SIL治療GIOP大鼠后，BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Conn.D與DEX組相比呈增加趨勢，表明骨小梁的微觀結構得到改善。

骨質疏松癥是一種發病率較高的骨代謝性疾病。GIOP在繼發性骨質疏松中占首位。研究表明，糖皮質激素治療開始3個月內，脊椎骨折的風險顯著增加，12個月時達到高峰。在連續接受糖皮質激素治療的患者中，骨折風險與每日口服糖皮質激素劑量密切相關[7]。因此，骨質疏松癥越來越受到研究者的關注。Milic等[8]總結了水飛薊賓的作用，并暗示水飛薊賓可能是預防或治療癌癥、動脈粥樣硬化、肝炎和肝硬化有潛力藥物。此外，研究發現水飛薊賓可通過抗氧化作用和PI3K/Akt途徑的調節來減輕高糖介導的hBMSCs功能障礙[4]。這些結果表明水飛薊素具有治療骨質疏松的潛力。

作為重要的抗氧化應激蛋白，FoxO調節抗氧化酶的表達，其中FoxO1是FoxO家族的主要成員。通過細胞特異性缺失和分子分析，在4種FoxO蛋白中，FoxO1是成骨細胞增殖和氧化還原平衡所需的唯一因子，因此FoxO1控制骨形成[9]。FoxO1主要通過PI3K/AKT信號途徑進行調節，FoxO1蛋白通過PI3K/AKT途徑磷酸化，導致FoxO1依賴的轉錄抑制和DNA結合能力受損[10]。AKT已被證明直接磷酸化并使FoxO1失活，從而導致細胞質保留、失活和抑制FoxO1調節基因的表達水平，這些基因控制各種過程，如代謝、細胞周期、細胞死亡和氧化應激[11]。相反，抑制PI3K/AKT途徑誘導活性FoxO1的去磷酸化和核轉位，然后這些過程增強FoxO1的轉錄活性，導致細胞周期阻滯和凋亡[12。這一系列研究表明，FoxO1是破骨細胞生成和骨吸收的主要控制節點，無論在生理還是病理條件下都是如此。本研究通過蛋白質印跡檢測AKT、磷酸化的AKT(p-AKT)、FoxO1和p-FoxO1水平。發現地塞米松提高了p-AKT/AKT的比例和p-FoxO1的蛋白質含量，但FoxO1的蛋白質水平卻有下降；用SIL處理后，AKT、磷酸化的AKT(p-AKT)、FoxO1和p-FoxO1改善明顯。這些結果表明SIL通過抑制PI3K/AKT信號通路能夠上調FoxO1轉錄活性來調控骨代謝。

骨生物力學中的骨結構力學指標測試是了解骨質疏松性骨折風險的最直接方法。它也是骨強度、骨骼結構和骨量的綜合表現。然而，觀察骨組織形態學和單獨測量骨密度不能完全反映骨質量。使用機械性質的干預效果的評估是治療骨質疏松癥的其他方法不可替代的。在本研究中，三點彎曲試驗表明，DEX組的最大載荷和彈性模量顯著低于CON組，SIL治療可顯著提高大鼠骨組織的抗折強度。血清CTX-I是骨骼中I型膠原的降解產物。檢測血清CTX-I水平可以特異性地反映破骨細胞的吸收活性。TRACP主要由破骨細胞釋放的非膠原蛋白產生，破骨細胞與膠原代謝物一起分泌在細胞外。因此，TRACP和CTX-1水平與骨吸收呈正相關。成骨細胞可以分泌骨特異性ALP，ALP是總ALP的重要組成部分，可以反映骨形成的狀態。OC是骨基質中最豐富的標志物，其由成骨細胞釋放到細胞外，反映骨形成的狀態。此外，骨形成標志物，包括OC、ALP和膠原蛋白1的表達，也顯著增加。本研究的結果表明SIL可增加成骨細胞活性和抑制破骨活性來促進GIOP大鼠的骨形成來保護骨組織。但是本研究有其不足之處如實驗動物較少且研究時間較短，需要進一步探索。

總之，水飛薊素可以通過PI3K/AKT/FoxO1信號通路調控骨代謝來改善骨密度、骨微觀結構和骨強度以及治療GIOP。