硫辛酸通過抑制NF-κB信號通路介導對老年大鼠骨量和骨密度保護作用

劉偉 趙寶輝 劉曉峰

河北大學附屬醫院骨三科，河北 保定 071000

骨質疏松癥(OP)是一種全身性疾病，其特征在于骨基質和礦物質的減少，導致骨小梁的破壞和破裂以及骨的脆性增加，從而降低生物力學性質[1]。OP主要影響絕經后的婦女和老年人，導致髖和脊柱骨折[2-5]。在過去的幾十年中，已經使用了雙膦酸鹽，地諾單抗和PTH類似物進行干預，它們是骨吸收的抑制劑或骨形成的刺激物[2-5]。 研究表明使用抗氧化劑可以清除自由基、改善睡眠、抗腫瘤、調節機體免疫反應和其他生物功能[6]；進一步研究這類藥物還可以介導體內甲狀腺素和降鈣素的分泌，從而調節體內鈣代謝[7]。近年來，抗氧化劑已被一些學者用于預防和治療OP[8]。然而，沒有關于硫辛酸與碳酸鈣結合預防和治療老年OP的報道。因此，本研究旨在通過在老年雌性大鼠中采用硫辛酸干預，觀察其對骨密度、骨量和氧化應激的影響，為臨床預防和治療老年骨質疏松提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

20只24月齡和10只3月齡雌性SPF級SD大鼠購自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.，Ltd(許可證編號SCXK 2012-0002；中國上海)。將大鼠飼養在籠中，控制溫度和光照周期(24 ℃和12/12光周期)，濕度為40 %并自由飲食。該研究經河北大學附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 實驗試劑和實驗儀器

硫辛酸(Sigma-Aldrich，San Francisco，CA，USA)。雙能X射線吸收測定儀(Hologic，Marlborough，MA，USA)；全自動生化分析儀(深圳市邁瑞生物醫藥電子有限公司)；連續波長多功能酶標儀(Tecan，Salzburg，Austria)。

1.3 實驗方案

20只老年雌性大鼠隨機分成2組，每組10只動物，老年組(Old組)和硫辛酸治療組(ALA組)；10只3月齡大鼠作為青年組(Con組)。所有大鼠在SPF系統中飼養，飼喂普通飼料，并在實驗過程中自由飲食。ALA組大鼠每天一次用60 mg/kg硫辛酸腹腔注射給藥； Con組和Old組大鼠每天腹腔注射生理鹽水連續治療12周。

1.4 影像學和組織學檢測

使用微型計算機斷層掃描(Micro-CT)(Skyscan 1176，Aartselaar，Belgium)對右股骨干骺端骨小梁結構進行了評估。分析了包括骨體積/組織體積(BV/TV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)和結構模型指數(SMI)在內的骨小梁參數。骨密度(BMD)使用Micro-CT檢測。使用Skyscan Nrecon軟件重建掃描圖像，并使用CTan軟件(Kontich，比利時)進行分析。使用CT Vox軟件(3.0版，Skyscan)獲得右股骨遠端區域的3D模型。隨后按照標準組織切片操作步驟，股骨干骺端使用EDTA(0.5 mol/L，pH=8.0)脫鈣后并包埋在石蠟中。使用切片機器切成5 μm厚切片，并用蘇木精和曙紅(HE)染色在顯微鏡下觀察。

1.5 檢測血清指標

測量骨密度后，從腹主動脈抽取血液，并在4 ℃以2 000 r/min離心10 min。分離血清并在-80 ℃下冷凍保存。采用全自動生化分析儀檢測血清鈣和磷。使用ELISA試劑盒(江林生物技術有限公司，中國 上海)測量血清抗酒石酸鹽酸性磷酸酶異構體5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b, TRACP-5b)。使用ELISA試劑盒(Zeye Biotechnology，中國 上海)測量血清I型膠原羧基端肽β特殊序列(β isomer of C-terminal telopeptide of type I collagen，β-CTX)、骨組織骨保護素(osteoprotegerin, OPG)和骨特異性堿性磷酸酶(bone alkalin phosphatase, BALP)水平。

1.6 蛋白印記(WB)檢測

在添加了蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中溶解骨髓組織，并進行低頻超聲處理。通過離心獲得含有總蛋白的上清液，其濃度通過二辛可寧酸蛋白測定法(Beyotime，中國 上海)測量。 根據目標蛋白的分子量，將等量的總蛋白上樣至10%或15%SDS PAGE。將蛋白質轉移到PVDF膜(Millipore)上，并在5%脫脂牛奶中于室溫下封閉2 h，然后在4℃下與NF-κB一級抗體(1∶2 000，Abcam)，Caspase-3(1∶2 000，CST)，PARP(1∶2 000，CST)，GAPDH(1∶10 000，Abcam)一起孵育過夜。用TBST洗滌3次后，將膜與第二抗體HRP山羊抗小鼠(ASPEN)在室溫下孵育1 h。 用Chemi Lumi One Ultra(Tanon，中國)檢測蛋白條帶的灰度。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠骨量和骨密度改變

所有組的大鼠股骨干骺端進行HE染色，以進一步觀察組織學變化，如圖1 A所示。在Old組中，組織學檢查顯示出大量的骨小梁已經消失和少量不規則排列的骨小梁。而使用ALA治療后，骨小梁的數量和之間的連接在一定程度上得到了改善。

Micro-CT三維重建結果和骨小梁定量結果如圖1 B所示；與Con組大鼠相比，Old組大鼠SMI的顯著升高，而Tb.Th、Tb.N和BV/TV的水平顯著降低(P均<0.05)。在ALA治療后，老年大鼠的骨小梁參數和骨密度表現出顯著改善。其中BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th值顯著升高；而SMI顯著降低。

圖1 各組大鼠股骨干骺端骨小梁形態學檢測結果注：與 Con組比較，*P<0.05、**P<0.01；與 Old組比較，#P<0.05。Fig.1 Morphological test results of femoral metaphyseal trabeculae in each group of rats

2.2 各組大鼠血清骨代謝指標的變化

各組之間的血清骨代謝水平如圖2中。三組大鼠治療12周后血清中Ca和P未見明顯改變(P>0.05)。與Con組大鼠相比，Old組大鼠血清中BLAP和OPG水平顯著降低；而TRACP-5b和β-CTX顯著升高(P<0.01)。然而，使用ALA治療顯著增加BLAP和OPG水平；而TRACP-5b和β-CTX顯著降低(P<0.01)。

圖2 各組大鼠血清骨代謝指標水平注：與 Con組比較，*P<0.05、**P<0.01；與 Old組比較，#P<0.05。Fig.2 Serum bone metabolism index levels in each group of rats

2.3 治療對NF-κB、Caspase-3和PARP表達的影響

ALA治療對NF-κB、Caspase-3和PARP表達的影響如圖3所示；圖3顯示了Old組大鼠的NF-κB、Caspase-3和PARP水平較Con組顯著增加(P<0.01)。與Old組相比，ALA治療后的股骨組織中NF-κB、Caspase-3和PARP表達被抑制(P<0.01)。

圖3 NF-κB、Caspase-3和PARP蛋白表達情況注：與 Con組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與 Old組比較，#P<0.05，##P<0.01。Fig.3 Expression of NF-κB, Caspase-3 and PARP proteins

3 討論

OP的主要特征是骨組織微觀結構的退行性變化，骨量減少和骨脆性增加，從而顯著增加骨折風險。OP在老年人中很普遍，年齡是OP的主要危險因素。近年來，隨著中國進入老齡化時期，OP的發病率逐年上升，其骨折等并發癥嚴重影響人們的生活。對OP的研究引起了中國和其他學者的廣泛關注。

硫辛酸是線粒體多酶復合物中天然存在的必需輔酶，其催化α-酮酸的氧化脫羧，例如丙酮酸、α-酮戊二酸和支鏈α-酮酸[9]；其已被證明是一種潛在的抗氧化劑。一些研究提供證據表明補充α-硫辛酸可以減少氧化應激并恢復體內其他抗氧化劑水平，也有證據表明其可能在體外發揮促氧化特性[9]，因為衰老導致線粒體膜結構惡化[9]?？寡趸瘎┚哂袕V泛的生物學功能，其機制不同；在骨代謝方面，抗氧化劑可以抑制破骨細胞的增殖和分化，促進成骨細胞的增殖和分化，并通過多種信號通路促進骨基質的礦化[10]。細胞實驗表明，抗氧化劑可以刺激骨細胞和成骨細胞的增殖[11]。此外，它可以上調runt2相關轉錄因子(RUNX2)的表達，抑制過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-γ)的表達，從而促進骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞[11]。動物實驗表明，抗氧化劑可顯著增加雄性小鼠的骨密度和骨小梁體積，但明顯減少破骨細胞的大小和數量[12]。本研究表明，硫辛酸的補充可顯著提高老年大鼠骨密度，提高骨密度，改善骨代謝。

由活性氧引起的骨毒性在OP的發生中起重要作用[13]。生物體中過多的骨吸收會增加活性氧的產生，導致破骨細胞和成骨細胞的破壞，導致骨量減少。隨著年齡的增長，體內自由基的含量逐漸增加，而吸煙、飲酒等不健康的生活方式可以誘導氧化應激，提高自由基水平，從而增加骨吸收[14]。動物實驗表明，隨著抗氧化劑水平的降低，體內抗氧化應激水平降低，而體內炎癥水平增加?？梢钥闯?，維持正常的抗氧劑水平可以減少自由基的損害[15]。NF-κB是通過促進炎癥因子分泌而誘導炎癥的關鍵信號[16]。NF-κB的活化可促進破骨細胞的分化和成熟，從而導致骨破壞并破壞骨形成[17]。本研究的數據表明，ALA可以通過抑制NF-κB信號介導炎癥反應而減少骨量的流失。

綜上，本研究發現ALA通過抑制NF-κB信號傳導保護老年大鼠骨量。但是，本研究存在一些局限性。具體而言，實驗模型的數量相對較少，因此導致測量數據有限。此外，除了股骨外，我們還沒有探討關節、脊柱、手腕或其他骨骼的骨質疏松癥。最后也是最重要的限制是我們只依靠Micro-CT來研究骨量，但是沒有進行生物力學測試來測量骨強度?？傊?，在本研究中，我們指出了ALA可預防老年大鼠的骨量丟失。