血清CCL4水平和絕經后骨質疏松癥嚴重程度相關性研究

楊劍 李清雪 仝瑞曉 陳景偉

1.河北省優撫醫院康復科，河北 石家莊 050051 2.石家莊市第四醫院婦科，河北 石家莊 050011 3.邯鄲市中醫院婦科，河北 邯鄲 056000 4.河北中醫學院中西醫結合婦產科學教研室，河北 邯鄲 050200

骨質疏松是人類骨骼的一種極其常見的疾病，其特點是骨強度下降，脆性骨折風險顯著增加[1]。女性比男性更常見，由于絕經后雌激素水平下降，其發病率顯著增加[2]。骨質疏松被認為是一種涉及內分泌和遺傳因素的多因素疾病。骨質疏松的主要診斷依據是骨密度以及腰痛[3]。然而，骨密度降低和影像學改變，如骨小梁減少或骨折，通常被解釋為中晚期骨質疏松的指征。為了早期發現骨質疏松患者骨代謝的變化，必須采用更新、更有效、更可靠的疾病監測手段。CCL4，又稱巨噬細胞炎癥蛋白-1β，與破骨細胞活性和骨代謝疾病的病理進程有關[4]。CCL4對多種細胞具有潛在的趨化作用，包括對冠狀動脈內皮細胞、未成熟樹突狀細胞、單核細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞等不同類型的細胞具有趨化作用。破骨細胞的遷移已被確定是包括骨質疏松在內的一些病理條件下的一個關鍵過程[5]。一項橫斷面臨床研究發現，骨質疏松患者的血清CCL4水平顯著高于健康對照組[6]。目前關于絕經后骨質疏松癥患者血清CCL4水平和骨質疏松癥嚴重程度目前研究有限，本研究的旨在探索絕經后骨質疏松癥患者血清CCL4水平和骨密度之間的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

2017年4月至2019年4月，66例絕經后女性患者(包括32例腰椎骨折)診斷為PMOP。骨質疏松定義為T值<-2.5。本研究的納入標準：50歲或以上絕經后骨質疏松癥患者。排除標準包括有骨骼系統疾病、癌癥、腎臟疾病、心力衰竭、缺血性心臟病和糖尿病的患者。此外，在2個月內接受了破骨細胞抑制劑和/或有機鈣治療的患者也被排除在外。同時選擇68例骨密度正常的絕經后婦女[絕經后非骨質疏松婦女(PMNOP)]和67例育齡健康婦女作為對照組。本研究方案都得到醫院倫理委員會的批準，所有受試者都簽署書面知情同意書。

1.2 指標評估

采用Oswestry殘疾指數(ODI)和視覺模擬評分法(VAS)評價PMOP患者的功能狀態和癥狀嚴重程度。ODI是對10種日常生活活動能力的評估，包括疼痛強度、旅行、社會活動、性活動、睡眠、站立、坐姿、步行、舉重和個人衛生。嚴重程度評分越高，表示殘疾程度越高。采用10 cm水平VAS量表評價下肢和腰痛的程度。研究方案將中度至重度疼痛定義為VAS>3，而輕度疼痛由VAS<3表示。

脊柱骨折的影像學評估基于脊柱成像的Genant半定量法[7]。骨折分為3級，椎體高度降低20%～25%、降低26%～40%、降低>40%分別為1級、2級和3級。

所有受試者在禁食過夜后進行靜脈采血。血液被收集到空置管中，然后立即離心以減少糖酵解。血清樣本在-80 ℃保存，直到檢測為止。用定量雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗試劑盒(Quantikine；R&D Systems，MN)對PMOP、PMNOP女性和健康對照者的CCL4水平進行盲法分析。CCL4批內和批間變異系數分別為4.36 %和3.25%。檢測范圍為31.2～2 000pg/mL。檢測炎癥標志物IL-6和血清Ⅰ型膠原C端末端肽(CTX-I)水平。

1.3 統計學處理

通過SPSS 21.0軟件分析所有研究的數據。結果以均數±標準差或中位數(四分位數范圍)表示。 通過Kolmogorov Smirnov檢驗評估數據分布的正態性。使用Mann WhitneyU檢驗或學生t檢驗分析兩組之間血清CCL4水平的差異。通過單因素方差分析或Kruskal Wallis分析，然后進行Tukey Posthoc分析，確定三組之間的差異。行Spearman或Pearson相關分析以評估CCL4血清水平與疾病嚴重性相關性。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

表1描述了本研究的所有參與者的基線臨床特征。患者隊列包括66名PMOP女性，平均年齡(62.4±5.1)歲；68名年齡匹配的PMNOP女性，平均年齡(60.7±4.4)歲和67名健康育齡婦女，平均年齡(42.7±4.1)歲。一般人體特征參數(包括BMI和年齡)在PMOP和PMNOP組之間差異無統計學意義。與PMNOP和對照組相比，PMOP中IL-6和CTX-1標志物顯著升高。此外，觀察到PMOP組患者的股骨頸和L1-L4BMD顯著低于PMNOP和健康對照組。

與PMNOP和對照相比，PMOP中血清CCL4水平增加(P<0.05)，見表1和圖1。PMNOP與健康對照組血清CCL4水平差異無統計學意義。此外，與PMOP中的非骨折組相比，骨折組血清CCL4水平顯著升高(P<0.05)，見圖1。

表1 受試者的基線臨床特征參數及骨密度

圖1 血清CCL4水平比較Fig.1 Comparison of serum CCL4 levels

使用Genant分級系統，PMOP相關骨折患者被分為3個不同的組。12名患者被分為1級，11名被分為2級，9名被分為3級。Genant 3級血清CCL4水平顯著高于Genant1級(P<0.05)。雖然Genant 3級與Genant 2級、Genant 2級與Genant 1級的差異無統計學意義；但是呈現一種趨勢，具有較高Genant等級的患者表現出較高的血清CCL4水平。血清CCL4水平與Genant等級呈正相關(r=0.580，P<0.05)。見圖2。

圖2 血清CCL4水平與Genant分級和BMD之間的相關性Fig.2 Associations between serum CCL4 level and Genant grade and BMD

進一步檢測血清CCL4水平以探討其與PMOP患者的BMD和Genant分級的相關性。發現較高的CCL4水平與較低的股骨頸BMD(r=-0.396，P=0.001)和較低的腰椎(L1-L4)BMD相關(r=-0.364，P=0.003)，見圖2。然而，PMNOP與健康對照組比較，血清CCL4水平與股骨頸和腰椎BMD無顯著相關性。為了說明CCL4水平是否與PMOP的癥狀嚴重程度相關，進一步探討了血清CCL4水平和VAS以及ODI之間的關系。發現CCL4水平與VAS(r=0.455，P<0.001)和ODI(r=0.499，P<0.001)呈正相關，見圖3。另外血清CCL4水平與CTX-1(r=0.432，P<0.001)和IL-6(r=0.437，P<0.001)也呈正相關，見圖3。但血清CCL4水平與PMNOP和健康對照組的CTX-1和IL-6水平無顯著相關性。

圖3 血清CCL4水平與VAS評分、Oswestry指數、血清I型膠原和IL-6水平的相關性Fig.3 Association of serum CCL4 levels with VAS scores, Oswestry indices, serum type I collagen and IL-6 levels

3 討論

本研究旨在確定PMOP患者血清CCL4水平與疾病嚴重程度之間的關系。本研究發現和健康對照組相比，PMOP血清CCL4水平顯著升高。此外，血清CCL4水平與PMOP女性中較低的BMD、骨折、臨床嚴重程度和骨質疏松相關標志物呈相關性。在調整年齡和BMI后，這些差異仍然很大。

現有研究[8]證實，免疫系統對骨質疏松癥的發病機制有重要作用，炎性趨化因子在骨質疏松癥中起關鍵作用的是骨重建因子。通過參與刺激破骨細胞祖細胞的成熟和遷移，趨化因子信號與經典M-CSF/RANKL介導的破骨細胞分化途徑有關[9]。以前的研究，包括小鼠和原代人類細胞培養的遺傳實驗，已經證明趨化因子在生理條件下影響破骨細胞的分化和遷移[10-11]。本研究發現CCL4水平與股骨頸和L1-L4腰椎的BMD呈負相關。此外，CCL4水平與椎體骨折的影像學分級呈正相關。這兩項研究結果表明CCL4可能在破骨細胞活性中起重要作用。

破骨細胞來源于單核細胞/巨噬細胞前體細胞，后者又是造血祖細胞的后代。骨吸收是一個動態過程，需要破骨細胞分化，激活和遷移到再吸收部位[12]。在一項體外細胞研究中，在向培養基中加入特異性抗CCL4抗體后，RANKL誘導的遷移破骨細胞數量顯著下降[13]。在多發性骨髓瘤細胞中，CCL4可能是溶骨性病變發展中的主要破骨細胞激活因子[14]。所有這些發現都暗示CCL4是破骨細胞活性所必需的。本研究表明血清CCL4水平與疼痛和功能顯著相關。

研究認為神經系統通過控制骨重建和局部血流來調節骨組織生物學的性能[15]。實際上，已經發現周圍神經系統密切調控骨骼功能。高度支配骨骼系統的神經纖維包括富含肽的降鈣素基因相關肽陽性纖維和受體激酶A中的A-δ原肌球蛋白等[16]。盡管年齡導致骨質量減少，但支配骨骼的神經元數量在整個人的生命周期內保持相對靜止[17]。骨骼中神經連接的存在直接影響骨重建，維持內部動態平衡并控制合成代謝和分解代謝的骨代謝。一項涉及使用小鼠PSNL模型的研究調查了CCL4如何影響神經性疼痛[18]。發現經歷坐骨神經損傷的小鼠模型在施萬細胞和損傷部位的巨噬細胞中具有CCL4表達的增加。此外，CCL4抗體能夠減輕這些病理特征。

總之，這些發現表明CCL4可能是促進PMOP患者疼痛感的重要因素。我們進一步檢查了血清CCL4水平與骨轉換標志物CTX-1以及骨質疏松癥相關炎癥標志物IL-6之間的關系。已經證實血清CTX-1值在骨吸收加速的條件下升高；通過分析血清CTX-1水平，可以檢測到骨質疏松癥中骨轉換增加以及繼發于絕經后骨吸收增加[19]。IL-6已被確定為炎癥細胞因子，主要在絕經后期刺激破骨細胞轉化[20]。本研究表明血清CCL4與血清CTX-1和IL-6之間的顯著相關性。

綜上，本研究發現，與PMNOP和健康對照者相比，PMOP患者血清CCL4水平顯著升高。較高的CCL4水平與癥狀和影像學嚴重程度增加以及較低的BMD相關。目前的研究表明CCL4具有能夠預測PMOP疾病嚴重程度的生物標志物的潛力。