基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究芪芍通脈湯治療冠心病的作用機(jī)制

朱春臨，吳佳蕓，李瑞菡，景瑞青，黃 力

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病簡(jiǎn)稱冠心病，是由于冠狀動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血、缺氧或壞死所引起的心臟病，現(xiàn)代臨床將其分為穩(wěn)定型冠心病和急性冠脈綜合征，治療主要有基礎(chǔ)藥物治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療、行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)，不論是否行血運(yùn)重建，基礎(chǔ)藥物治療仍是一切治療的基礎(chǔ)[1]，但目前單純西藥治療存在部分療效欠佳、臨床癥狀改善有限、安全性有待加強(qiáng)等問(wèn)題。近年來(lái)有研究表明，中藥復(fù)方在治療疾病，改善癥狀方面存在一定優(yōu)勢(shì)，為臨床藥物選擇擴(kuò)展了空間，故行中西醫(yī)結(jié)合治療即“病證結(jié)合”是臨床較佳模式[2]，能夠最大限度地使病人獲益。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，冠心病屬“胸痹”“心痛”“真心痛”范疇，基本病機(jī)以氣虛為本、血瘀為標(biāo)。芪芍通脈湯為黃力教授臨床治療冠心病的經(jīng)驗(yàn)用方，立方以補(bǔ)虛為主，同時(shí)配合活血化瘀安神之品，作為臨床治療冠心病基礎(chǔ)方劑，經(jīng)臨床驗(yàn)證效佳；但該復(fù)方治療冠心病的有效活性成分及作用機(jī)制尚不明了，有關(guān)復(fù)方藥理學(xué)研究仍處于單藥研究階段，故此采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析復(fù)方化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，為后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 復(fù)方化學(xué)成分和靶點(diǎn)信息收集 以口服生物利用度(OB)>30%、化合物類藥性(DL)>0.18為篩選條件，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php)分別檢索黃芪、赤芍、川芎、降香、葛根、酸棗仁共6味藥物的化學(xué)成分及相關(guān)成分的潛在靶點(diǎn)。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的信息收集 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.omim.org)進(jìn)行檢索，獲得冠心病相關(guān)靶點(diǎn)，收集整理后建立冠心病相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將疾病靶點(diǎn)與藥物成分靶點(diǎn)進(jìn)行交集處理，獲得疾病-藥物共同靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。將篩選到的疾病-藥物共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org)，限定物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為中等“highest confidence”(>0.9)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件，將復(fù)方治療冠心病的作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行“成分-疾病-藥物”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，通過(guò)分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)中心度(degree)、中介中心性(between ness centrality，BC)和接近中心性(closeness centrality，CC)等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)篩選核心節(jié)點(diǎn)，以此探究成分-疾病-藥物之間的網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性，其中選取條件設(shè)置為≥平均數(shù)。為明確復(fù)方治療冠心病的作用靶點(diǎn)在生物信號(hào)通路中的作用，將篩選到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)，進(jìn)行KEGG通路富集分析及GO功能富集分析。選取排名前20位的生物過(guò)程和通路，結(jié)合文獻(xiàn)檢索，篩選出治療冠心病的可能通路。

2 結(jié) 果

2.1 芪芍通脈湯化學(xué)成分及其靶點(diǎn)與疾病靶標(biāo)的篩選 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索全方，同時(shí)檢索中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(CNKI)、中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(VIP)、萬(wàn)方知識(shí)服務(wù)平臺(tái)、PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)，剔除無(wú)靶點(diǎn)化合物，共得到有效成分106個(gè)，其中黃芪20個(gè)、赤芍29個(gè)、川芎7個(gè)、葛根4個(gè)、酸棗仁9個(gè)、降香37個(gè)。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)有效成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，去除重復(fù)值后，篩選出453個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，其中黃芪86個(gè)、赤芍74個(gè)、川芎18個(gè)、葛根37個(gè)、酸棗仁17個(gè)、降香221個(gè)。通過(guò)GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，共搜集到3 175個(gè)冠心病相關(guān)靶點(diǎn)。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將453個(gè)藥物成分靶點(diǎn)與3 175個(gè)疾病靶點(diǎn)兩者取交集，同時(shí)繪制韋恩圖(見圖1)，共得到66個(gè)疾病-藥物成分共同靶點(diǎn)。將66個(gè)疾病-藥物共同靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，共獲得66個(gè)節(jié)點(diǎn)、559個(gè)相互關(guān)系，其中平均節(jié)點(diǎn)16.9個(gè)，期望邊數(shù)144個(gè)。圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)。詳見圖2。

2.3 有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)分析 在Cytoscape 3.7.2軟件中導(dǎo)入有效成分、靶點(diǎn)、疾病的相關(guān)信息，構(gòu)建有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。在該網(wǎng)絡(luò)中，淺綠色代表有效成分，紫色代表共同靶點(diǎn)，藍(lán)綠色代表復(fù)方，紅色代表疾病。節(jié)點(diǎn)代表活性成分、靶點(diǎn)、疾病，邊代表三者之間存在的相關(guān)關(guān)系。節(jié)點(diǎn)面積大小與Degree數(shù)值大小成正比，節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)連接較多的靶點(diǎn)是關(guān)鍵靶點(diǎn)。同時(shí)根據(jù)分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的Degree、BC、CC篩選出相關(guān)靶點(diǎn)。詳見表1。

圖1 疾病-成分靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 復(fù)方靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

2.4 芪芍通脈湯作用機(jī)制分析 將復(fù)方治療冠心病的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO及KEGG通路富集分析，以P< 0.01 為閾值篩選富集數(shù)量較多的通路與生物過(guò)程，其中富集占相應(yīng)通路比例越大、P值越小的通路，與復(fù)方中活性成分治療冠心病的關(guān)系更密切。詳見圖4、圖5。復(fù)方分子功能主要有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等。KEGG分析結(jié)果示多個(gè)生物過(guò)程與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中主要富集于流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、AGEs-RAGE信號(hào)通路(AGEs-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、IL-17信號(hào)通路(signaling pathway)、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、人類巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)等。

圖3 有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 主要成分潛在靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過(guò)程分析

圖5 KEGG通路富集分析

3 討 論

芪芍通脈湯為黃力教授臨床治療冠心病經(jīng)驗(yàn)方，主以補(bǔ)氣活血、化瘀安神。黃力教授認(rèn)為冠心病為本虛標(biāo)實(shí)之證，氣虛為本，血瘀為標(biāo)，血瘀日久化熱傷津；又心主神志，心氣血不充，神志不安，故處方用藥應(yīng)主次分明；方中以黃芪為君，其味甘性微溫，取其補(bǔ)氣行氣之力，臨床應(yīng)用以生品為多，用量為30～90 g；川芎、赤芍、降香相使為臣，主以活血化瘀止痛；葛根生津舒筋、棗仁養(yǎng)血安神共為佐。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪富含多種微量元素，可通過(guò)其正性肌力作用、降低心肌耗氧量、提高心肌抗氧化能力等多種機(jī)制聯(lián)合作用從而達(dá)到保護(hù)缺血損傷心肌的目的[3-4]；川芎在保護(hù)血管內(nèi)皮、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心肌缺血再灌注損傷、抗炎、抗氧化應(yīng)激等方面表現(xiàn)突出；川芎嗪注射液可以改善冠狀動(dòng)脈的血液循環(huán)，減輕缺血引起的心肌細(xì)胞損傷[5-6]；赤芍可增加冠狀動(dòng)脈血流量，增加心排血量，抗實(shí)驗(yàn)性心肌缺血，改善微循環(huán)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)赤芍可阻礙動(dòng)脈損傷后內(nèi)膜增生，抑制平滑肌細(xì)胞增殖[7]；葛根能擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，緩解血管壓力，葛根素具有清除氧自由基、抗氧化、減少心肌耗氧量、減低血液黏度、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善缺血心肌及周圍循環(huán)血液供應(yīng)等作用[8]；降香可降低血瘀動(dòng)物的血液黏度，改善心肌重構(gòu)，抗血栓、血小板聚集，舒張血管、抗氧化[9-10]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，酸棗仁能夠鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥，抗實(shí)驗(yàn)性心肌缺血，降低膽固醇[11-12]。各單藥經(jīng)現(xiàn)代藥理研究證明均具有保護(hù)心臟的作用，但復(fù)方治療冠心病的靶點(diǎn)通路尚不明了。

本研究通過(guò)擬合復(fù)方治療冠心病的“有效成分-靶點(diǎn)-疾病”拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)與復(fù)方關(guān)聯(lián)度較大的化學(xué)成分主要有槲皮素、β-谷甾醇、黃芩素、刺芒柄花素、鞣花酸、楊梅酮、谷甾醇、豆甾醇、異黃烷等，其中現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可阻止缺氧后肺動(dòng)脈高壓、右心室肥大，改善心肌重構(gòu)，抑制PASMCsd的異常增殖，從而改善心肺功能[13]；β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇作用[14-17]；刺芒柄花素在體內(nèi)具有雌激素樣作用、降血脂、抗脂質(zhì)過(guò)氧化，能夠改善動(dòng)脈粥樣硬化，清除氧自由基，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等作用[18-22]；鞣花酸可以有效抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化[23]。臨床藥理研究發(fā)現(xiàn)，異黃酮在降糖降脂、改善胰島素抵抗、抑制相關(guān)葡萄糖代謝酶活性和抗糖尿病氧化損傷等方面表現(xiàn)突出[24-25]。關(guān)聯(lián)度較大的化學(xué)成分有可能是復(fù)方治療冠心病的主要成分；通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)及生物學(xué)功能分析，綜合排名前10位的靶點(diǎn)分別為PTGS1、ESR1、PPARG、ESR2、PGR、AR、GSK3B、NCOA1等靶點(diǎn)，主要具有調(diào)節(jié)激素分泌、抗凝、調(diào)脂、改善認(rèn)知狀態(tài)等作用[26-31]，表明該類靶點(diǎn)可能是復(fù)方治療冠心病的主要靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)多為參與流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路、AGEs-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、EB病毒感染等多條信號(hào)通路的關(guān)鍵基因，其通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡、炎癥反應(yīng)、激素水平、脂質(zhì)代謝等可能機(jī)制，發(fā)揮協(xié)同治療冠心病的潛在作用。

在預(yù)測(cè)通路中，復(fù)方與IL-17通路及AGEs-RAGE通路關(guān)聯(lián)度較大，現(xiàn)代臨床認(rèn)為IL-17信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中起到重要作用，IL-17細(xì)胞因子家族由IL-17a、IL-17b、IL-17c、IL-17d、IL-17e和IL-17f組成，在免疫反應(yīng)中主要起到促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用。現(xiàn)代臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IL-17通路被激活后不僅直接加速心室重構(gòu)的發(fā)展過(guò)程，還可以通過(guò)加速血管的動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程，增加左心室后負(fù)荷，從而加速心室重構(gòu)過(guò)程。此外，該免疫通路激活后可以促進(jìn)冠狀動(dòng)脈硬化發(fā)展過(guò)程，導(dǎo)致心肌缺血進(jìn)一步加重，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)[32-36]。糖尿病是冠心病發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)AGEs-RAGE信號(hào)通路與糖尿病發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)：AGEs為晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)，其在血管壁損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、動(dòng)脈粥樣硬化病變中都發(fā)揮重要作用，AGEs與其受體RAGE參與并介導(dǎo)氧化應(yīng)激的多種信號(hào)通路促使活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，激活核因子-κB，分泌大量炎性因子，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和炎癥反應(yīng)，加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展[37-38]。

芪芍通脈湯中同一有效成分可調(diào)控不同靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)可與不同有效成分相對(duì)應(yīng)，同時(shí)可參與不同信號(hào)通路及生物學(xué)過(guò)程，體現(xiàn)了該復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。但本研究基于數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘，研究結(jié)果尚存在一定的局限性，后續(xù)應(yīng)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行篩選和體內(nèi)外試驗(yàn)，從而進(jìn)一步明確該復(fù)方的主要調(diào)控通路及生物學(xué)過(guò)程。