天麻鉤藤膏改善自發性高血壓大鼠心肌纖維化的作用及其機制研究

田夢影，宋雪云，李曉屏，蔡嘉洛，徐則林，蔡虎志

高血壓病是嚴重危害人類健康的一種常見、高發慢性疾病[1]。心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF) 是高血壓病心肌病變的主要病理變化，也是導致多種心血管疾病及猝死發生的重要原因之一[2]。許多研究表明，心肌細胞炎癥反應以及膠原的合成降解失衡是導致心肌纖維化的重要機制之一。天麻鉤藤膏是目前臨床上用于治療肝腎陰虛型、肝陽上亢型高血壓病的經典方劑，其臨床療效確切且副作用輕微，較西藥有一定優勢。本研究以自發性高血壓大鼠(SHR)為模型，觀察天麻鉤藤膏對SHR心肌纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組干預 SHR，雄性，16周齡，50只，SPF級，體質量230～250 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。合格證號編號：scxk(滬)2017-002。正常血壓(Wistar-Kyoto，WKY)大鼠，雄性，16周齡，10只，SPF級，體質量230～250 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。合格證號編號：scxk(滬)2017-023。

1.1.2 藥物制備 天麻鉤藤膏組方：丹參15 g，天麻9 g，鉤藤12 g(后下)，石決明18 g(先煎)，梔子9 g，黃芩9 g，杜仲9 g，桑寄生9 g，夜交藤9 g，茯神9 g，牛膝12 g，益母草9 g。以上藥物20劑，浸泡12 h后用武火加熱至沸騰，改調文火加熱煎煮，常壓煎煮時間為2 h，煎液濾出，置潔凈桶內；第2次煎煮再加8倍量水，繼續加熱至沸騰，常壓煎煮時間不少于1 h，將煎液濾出置潔凈桶內，合并兩次濾液。藥渣壓榨，壓榨液與濾液合并后靜置10 h，取上清液過100目篩。將2次煎液混合后濃縮至密度1.10～1.15，沖入預先烊化的阿膠500 g，最后加入元貞糖516 g(膏方總量的20%)、鱉甲膠387 g(膏方總量的15%)。煉制收膏，每毫升膏劑約含生藥2.8 g，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制作。卡托普利片(廣東彼迪藥業有限公司生產)0.25 mg，研磨成粉后經雙蒸水溶解，制備成每毫升含生藥 10 mg的藥液，4 ℃保存備用。

1.1.3 主要試劑及實驗儀器 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白(MCP-1)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)分型檢測試劑盒均購于珠海市泛海生物科技有限公司。JA11001型電子精密天平(上海雙旭電子有限公司)，SYNGENE ChemGenius成像系統(Syngene公司)，WMF-3650研究型倒置熒光顯微鏡(上海無陌光學儀器有限公司)，HT7700透射電鏡(日本日立公司)，DRM+Q550型病理圖像分析儀(德國LEICA公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及灌胃 SHR應用隨機數字表法分為5組：即模型組、卡托普利組(予卡托普利片陽性藥物0.025 g/kg)、天麻鉤藤膏高劑量組(給予天麻鉤藤膏24.36 g/kg)、天麻鉤藤膏中劑量組(給予天麻鉤藤膏11.34 g/kg)、天麻鉤藤膏低劑量組(給予天麻鉤藤膏5.36 g/kg)，另以10只16周齡WKY大鼠為空白對照組。以人等效量=[1×大鼠體表面積/成人平均體表面積×成人每日用量]的方法計算卡托普利片和天麻鉤藤膏每日灌胃劑量，每日1次灌胃。療程為4周。6組均以蒸餾水同時開始灌胃，空白對照組自由飲水，療程 4周。

1.2.2 心臟重量指數測定 在最后1次給藥后即刻停止喂食，提供飲水，飼養12 h后，稱重，10%水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g)，腹主動脈采血后取心臟，生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分，稱取重量作為心臟重量。沿房室交界處剪去心房和右心室，剩余的左心室稱取重量作為左室重量(LVW)。并計算左室質量指數(LVWI)。

1.2.3 心肌組織膠原病理形態定性定量分析 病理標本的制備，取左室中段橫截面( 冠狀切面) 心肌組織做病理切片，常規固定(10%中性甲醛)、包埋和制片，每只鼠取切片2張，切片厚4～5 μm，進行HE染色和VG染色，清晰顯示心肌細胞和膠原組織。在VG染色下，心肌細胞呈黃色，膠原呈紅色。

1.2.4 病理標本檢測 以電子透鏡和圖像分析系統測量心肌膠原容積分數心肌膠原含量(collagen volume fraction，CVF)和心肌血管周圍膠原面積和管腔面積比例(perivascular circumferential area，PVCA)。通過灰度調節區別膠原和非膠原成分。計算方法：CVF=膠原面積/總面積，其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積。隨機分析5個視野，取其均值作為該心臟的CVF。PVCA=壁內小動脈管腔周圍膠原面積/動脈管腔面積。每一標本取4根壁內小動脈橫切面進行測量，取其均值作為該心臟的PVCA。

1.2.5 血清TNF-α、MCP-1、G-CSF檢測 嚴格按照TNF-α、MCP-1、G-CSF檢測試劑盒說明書方法進行操作。

2 結 果

2.1 各組大鼠LVW、LVWI、心肌膠原含量變化比較 模型組大鼠LVWI、LVW及心肌膠原含量均高于空白對照組大鼠，差異具有統計學意義(P<0.01)；卡托普利組及天麻鉤藤膏高、中、低劑量組大鼠LVWI、LVW及心肌膠原含量均明顯低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.01)；表明天麻鉤藤膏能明顯減輕心臟質量并降低膠原含量。詳見表1。

表1 各組大鼠LVW、LVWI、心肌膠原含量變化比較 (±s)

2.2 各組大鼠PVCA、CVF的變化 模型組PVCA和CVF均高于空白對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)；天麻鉤藤膏高、中、低劑量組及卡托普利組PVCA和CVF與模型組比較均明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)；天麻鉤藤膏高劑量組與卡托普利組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，說明天麻鉤藤膏可有效促進心肌膠原的降解。詳見表2。

表2 各組大鼠PVCA、CVF變化比較 (±s) 單位：%

2.3 各組大鼠血清中TNF-α、MCP-1、G-CSF的變化模型組 TNF-α、MCP-1、G-CSF均高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.01) ；與模型組比較，天麻鉤藤膏高、中、低劑量組及卡托普利組TNF-α、MCP-1、G-CSF均下降，差異有統計學意義(P<0.01)；天麻鉤藤膏高劑量組與卡托普利組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；說明天麻鉤藤膏可明顯降低炎癥反應。詳見表3。

表3 各組大鼠血清中TNF-α、MCP-1、G-CSF變化比較 (±s) 單位：nmol/L

2.4 各組大鼠心肌細胞組織結構變化(見圖1)

圖1 電鏡下各組大鼠心肌細胞組織的顯微結構(×100)

3 討 論

近年來研究表明，高血壓病是一種慢性炎癥性疾病，其引起的心肌纖維化是心血管疾病的重要危險因素之一[3]。心肌纖維化是機體對于心肌細胞損傷修復的一種失控的炎癥表現，一旦心肌細胞發生損傷，大量的炎性細胞浸潤、炎性因子分泌，形成一個炎癥環境，促使成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，同時分泌細胞外基質，造成纖維化。

中醫學將高血壓病稱“眩暈”，認為“正虛邪戀，邪盛致虛”是高血壓病發病的根本之所在[4]。《素問·至真要大論》曰：“諸風摔眩，皆屬于肝”[5]。《類證治裁·眩暈》也認為：“良由肝膽乃風木之臟……震眩不定”。由此說明肝在高血壓病發病機制中的重要地位[6]。天麻鉤藤膏是經方天麻鉤藤湯調制而成，具有滋補肝腎、平肝潛陽的功效，是歷代醫家用于治療高血壓病的經典方劑之一。本研究發現SHR的LVWI、LVW、心肌膠原含量、PVCA、CVF等指標從不同層面反映左室肥厚以及心肌纖維化的程度，其中LVWI和LVW能較好地反映左心室肥厚程度，但對高血壓病早期的心肌纖維化敏感性較差；心肌膠原含量則可直接反映心肌細胞膠原含量水平。有研究表明PVCA和CVF這兩項指標分別代表高血壓病心肌纖維化病變的兩種主要形式，即血管周圍纖維化程度與間質纖維化的病變程度[7]。本研究顯示：天麻鉤藤膏能明顯降低SHR的LVWI、LVW、心肌膠原含量、PVCA及CVF，從而逆轉左室重構以及阻滯心肌纖維化的進程，其效果與卡托普利比較差異有統計學意義(P<0.01)。而藥物治療過程中，大鼠血清中炎性因子TNF-α、MCP-1、G-CSF均降低，說明天麻鉤藤膏可一定程度上抑制炎癥反應的發生，降低炎性因子濃度。

天麻鉤藤膏具有改善高血壓病心肌纖維化的作用，其可能是通過降低炎性因子TNF-α、MCP-1、G-CSF水平，從而抑制心肌膠原合成，達到其逆轉心肌纖維化及左室肥厚的作用。但高血壓病引起的心肌纖維化病理機制較復雜，天麻鉤藤膏對心肌纖維化的干預作用是否有其他因素參與，尚待更深入的研究進一步確定。