田黃顆粒對(duì)腦出血大鼠腦水腫及水通道蛋白-4 mRNA的影響

劉清娥，于曉凡，楊家玥，陳 強(qiáng)

腦出血是發(fā)病急、病勢(shì)兇、預(yù)后差的一類(lèi)急性腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率、高經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的“五高”特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命安全。腦水腫是腦出血急性期最關(guān)鍵的病理過(guò)程，決定了腦出血疾病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后，減輕腦水腫是治療急性腦出血的關(guān)鍵[1-2]。目前，甘露醇、甘油果糖、呋塞米、激素等藥物治療腦水腫得到公認(rèn)，但存在水電解質(zhì)代謝紊亂、腎功能損害、血壓驟降等副作用。田黃顆粒是近幾年研究的具有腦出血后腦保護(hù)作用的中藥顆粒劑，在腦出血治療中發(fā)揮出一定優(yōu)勢(shì)，前期研究觀察到田黃顆粒可有效抑制腦出血大鼠炎性細(xì)胞因子表達(dá)，降低腦出血病人基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)，減輕腦損傷后炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)及腦水腫、腦血腫體積，改善神經(jīng)功能，起到腦保護(hù)作用[2-4]。本研究旨在前期研究基礎(chǔ)上，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究田黃顆粒干預(yù)腦出血、減輕腦水腫效應(yīng)及對(duì)水通道蛋白-4 mRNA(AQP-4 mRNA)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，清潔級(jí)，購(gòu)自維通利華公司(動(dòng)物合格證號(hào)：11400700133176)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 田黃顆粒(三七、大黃、冰片)、20%甘露醇。三七顆粒(華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1510001s)、大黃顆粒(華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1603001s)、冰片(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1511004)3種藥物比例為10∶40∶1。20%甘露醇(百特醫(yī)療有限公司，批號(hào)H20073135)。

1.1.3 RT-PCR試劑盒 由大連寶生物工程有限公司提供，引物由上海生工工程有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模及納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 按照Rosenberg等報(bào)道的[5]方法復(fù)制大鼠腦出血模型。參照Z(yǔ)ea-Longa評(píng)分法[6]，分為5級(jí)(0～4分)，于大鼠清醒后進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分在2～3分的大鼠用于本實(shí)驗(yàn)。2分以下及3分以上剔除。

1.2.2 動(dòng)物分組 選用造模成功的SD大鼠，隨機(jī)分為4組：模型組；中藥組，每日按6 g/(kg·d) 劑量給予田黃顆粒灌胃；西藥組，經(jīng)大鼠尾靜脈用輸液泵持續(xù)泵入20%甘露醇10 mg/kg，60 min內(nèi)滴完，每8 h給藥1次；中西藥組，給藥方法為中藥組及西藥組給藥方法的聯(lián)合用藥。田黃顆粒給藥劑量換算參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[7]。各組大鼠分別于術(shù)后第1天、第3天、第7天觀察各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3 觀察指標(biāo) ①腦組織含水量測(cè)定：干-濕重法測(cè)定腦組織含水量，大鼠斷頭處死取腦，沿腦橋上界水平切斷，棄去小腦及雙側(cè)嗅球，將剩余腦組織沿中線切開(kāi)，濾紙吸干表面水分，分別稱(chēng)取左右兩側(cè)腦組織濕重，恒溫烤箱110 ℃烘干至恒重后稱(chēng)取干重，計(jì)算各組模型大鼠左右兩側(cè)腦組織的含水量，腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重。②腦組織AQP-4 mRNA的測(cè)定：分別取各組大鼠出血腦組織右半部分進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。按照RT-PCR兩步法試劑盒操作說(shuō)明操作。③行為學(xué)評(píng)分：Zea-Longa評(píng)分法，0分為無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀；1分為不能完全伸直左前爪；2分為向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為行走時(shí)向左側(cè)傾斜；4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦組織含水量測(cè)定結(jié)果 模型組大鼠術(shù)后第1天出現(xiàn)輕度腦水腫現(xiàn)象；第3天腦水含量明顯增加；第7天腦含水量較前下降。第1天時(shí)各治療組大鼠腦含水量與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第3天、第7天時(shí)各治療組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，中西藥組腦含水量低于中藥組和西藥組(P<0.01)，西藥組低于中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦含水量比較 (±s) 單位：%

2.2 各組大鼠AQP-4 mRNA的測(cè)定結(jié)果 模型組大鼠術(shù)后第1天腦組織AQP-4 mRNA開(kāi)始增高，第3天AQP-4 mRNA增高，第7天時(shí)AQP-4mRNA較前下降。第1天、第3天、第7天各治療組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，中西藥組AQP-4 mRNA較中藥組、西藥組下降明顯(P<0.05或P<0.01)，西藥組在第3天、第7天時(shí)AQP-4 mRNA下降優(yōu)于中藥組(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠AQP-4mRNA光密度積分比值比較 (±s)

2.3 各組大鼠Zea-Longa評(píng)分結(jié)果 第1天時(shí)各治療組大鼠Zea-Longa評(píng)分與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第3天和第7天，各治療組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，中西藥組大鼠評(píng)分優(yōu)于中藥組和西藥組(P<0.05或P<0.01)，西藥組優(yōu)于中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠Zea-Longa評(píng)分比較 (±s) 單位：分

3 討 論

腦出血屬于中醫(yī)學(xué)出血性中風(fēng)范疇，病變部位在腦，病機(jī)復(fù)雜，多為本虛邪實(shí)、痰瘀交結(jié)，上犯沖腦而發(fā)病。急性期以邪實(shí)為主，注重祛瘀活血、滌痰通絡(luò)、開(kāi)竅醒神。田黃顆粒主要成分是三七、大黃和冰片。君藥三七功善止血活血，具有化瘀止血、消腫止痛等功效，三七總皂甙是其主要藥理活性成分，具有改善心腦微循環(huán)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用[8]。大黃具有涼血祛瘀通經(jīng)之功效，具有抗凝和促凝雙向調(diào)節(jié)作用，在減輕腦出血病人的神經(jīng)功能損害、減輕腦水腫等方面有一定療效[9-10]。臣藥冰片芳香走竄，能夠開(kāi)竅醒腦祛痰、引藥上行，藥理研究發(fā)現(xiàn)冰片能有效促進(jìn)其他藥物透過(guò)血腦屏障而發(fā)揮最大作用，越來(lái)越多應(yīng)用于腦靶向給藥策略中[11]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，冰片能改善中風(fēng)后神經(jīng)血管單元功能，具有腦保護(hù)作用[12]。且本實(shí)驗(yàn)中大鼠灌胃冰片含量在口服冰片毒性安全范圍內(nèi)[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血大鼠術(shù)后第1天出現(xiàn)輕度腦水腫現(xiàn)象，第3天時(shí)腦含水量明顯增加，第7天時(shí)腦含水量較前下降。腦出血第3天和第7天時(shí)，中藥組可以明顯降低大鼠腦含水量，中西藥組與中藥組、西藥組比較，降低腦含水量作用更加明顯。說(shuō)明田黃顆粒能有效減輕腦出血急性期腦水腫，且在水腫高峰期效果顯著。劉青等[14]利用大黃干預(yù)腦出血大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大黃能夠減低腦出血大鼠模型腦組織含水量，減輕水腫，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)功能的作用。給予早期腦出血病人三七總皂甙注射液，可減輕腦血腫，緩解腦水腫[15]。

水通道蛋白是一種細(xì)胞膜通道蛋白，在水分子的跨膜流動(dòng)方面起著關(guān)鍵作用，分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的水通道蛋白有數(shù)種，以AQP-4分布最廣，主要分布于腦室系統(tǒng)的室管膜、蛛網(wǎng)膜下腔及血管周?chē)男切文z質(zhì)細(xì)胞以及滲透壓感受區(qū)，參與腦水穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，在腦血管病腦水腫形成和控制過(guò)程中起重要作用[16]。干預(yù)AQP-4的表達(dá)可以作為減輕腦水腫的治療靶點(diǎn)[17]。通過(guò)下調(diào)AQP-4的表達(dá)，可改善腦外傷大鼠的腦水腫[18]。抑制AQP-4的活性，降低腦含水量，減輕腦水腫繼發(fā)的顱腦損傷[16]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制AQP-4的表達(dá)不僅能抑制腦水腫，還可減少凋亡基因Caspase-3和增加抑制凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，減輕腦出血大鼠神經(jīng)元凋亡[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與模型組相比在治療的第1天、第3天、第7天，中藥組大鼠腦組織AQP-4 mRNA下降，而中西藥組AQP-4 mRNA下降優(yōu)于西藥組和中藥組，這與本研究在田黃顆粒緩解大鼠腦水腫的結(jié)果一致。蒙蘭青等[20]研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂甙治療組腦出血大鼠各時(shí)間點(diǎn)AQP-4的蛋白、mRNA均在低水平表達(dá)，腦含水量降低，減輕了腦水腫形成。彭紹鵬等[21]發(fā)現(xiàn)大黃素治療后腦出血大鼠腦組織含水量、腦組織中AQP-4含量均降低，提示大黃素能夠下調(diào)AQP-4的表達(dá)，減輕腦水腫，促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)。

本研究通過(guò)對(duì)大鼠行為學(xué)評(píng)分的觀察，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合田黃顆粒治療后腦出血大鼠行為學(xué)評(píng)分改善效果顯著，與本課題組前期研究結(jié)果一致。田黃顆粒能夠減輕急性腦出血后腦水腫，對(duì)西藥有一定的協(xié)同作用，其改善水腫療效機(jī)制可能與降低AQP-4 mRNA有關(guān)。當(dāng)然AQP-4并不是改善腦水腫的唯一因素，田黃顆粒也具有多途徑、多靶點(diǎn)的藥理作用，仍需進(jìn)一步地深入研究。