電針對MCAO 大鼠海馬中CACNα1D 的影響

羅 來 ，徐芳媛 ，許金森 ，潘曉華 ，黃倩茹 ，萬 隆

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建福州350108； 2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建福州350003）

腦卒中是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，也是世界第二大致死疾病，并且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，對全世界人民都造成了巨大的負(fù)擔(dān)［1］。針灸治療腦卒中在我國歷史悠久，《針灸甲乙經(jīng)》就有“偏枯，四肢不用，善驚，大巨主之”的記載，臨床療效也得到了廣泛的認(rèn)可，并且針灸療法具有方法多樣、經(jīng)濟(jì)簡便、不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)，適合在臨床推廣。對于針灸治療腦卒中的機(jī)制目前眾說紛紜，其中對鈣離子通道的研究一直是一大熱點(diǎn)，鈣離子通道與心肌和血管平滑肌的功能正常與否有著重要的聯(lián)系。有研究表明大腦內(nèi)存在鈣離子依賴性的神經(jīng)遞質(zhì)分泌，可能在腦缺血再灌注后超級化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道通過增加鈣離子內(nèi)流，誘發(fā)神經(jīng)元興奮毒性，從而參與缺血再灌注損傷的分子機(jī)制［2］。因此，本研究通過觀察電針對大腦中動(dòng)脈閉塞模型（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠的腦卒中癥狀的影響和缺血側(cè)海馬CACNα1D mRNA 表達(dá)來探討電針治療腦卒中的機(jī)制，為電針治療腦卒中提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用成年SD 雄性大鼠21 只，均由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，體質(zhì)量（300±20）g，每籠 7只大鼠，均自由進(jìn)食及飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。飼養(yǎng)條件：溫度（22±2）℃，濕度（55±15）%，12 h 明暗交替，自由進(jìn)食與飲水。實(shí)驗(yàn)過程中均嚴(yán)格按照國際動(dòng)物保護(hù)及使用指南的規(guī)定進(jìn)行。

1.1.2 試劑與儀器 華佗牌30 號(hào)0.5 寸不銹鋼毫針（中國上海）、SDZ-II 型華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）、小動(dòng)物呼吸麻醉系統(tǒng)（深圳瑞沃德生命科技公司，R407），L3800 號(hào)大鼠用MCAO 線栓（廣州佳靈生物技術(shù)有限公司）、NANODROP RNA 質(zhì)量檢測儀（美國Thermo 公司）、海爾-80 ℃冰箱（中國山東）、ABI step one plus 熒光定量 PCR 儀（美國 Applied Biosystems 公司）、q-PCR 試劑盒 （北京 TRAN 公司）、Fast Quantity RT Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根生化科技公司，KR106）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與造模 將18 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為電針組、模型組、假手術(shù)組。電針組和模型組參照 Longa 改良線栓法［3］，在大鼠左側(cè)行MCAO手術(shù)，具體操作方法為：大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h。將大鼠投入透明麻醉誘導(dǎo)盒中，體積為25 cm×12 cm×20 cm，開啟異氟烷流量并調(diào)至500 mL/min，濃度調(diào)至5%，持續(xù)1 min，待大鼠呼吸平穩(wěn)緩慢，縮爪反射消失后，將大鼠取出戴上呼吸面罩，并將流量調(diào)為300 mL/min，濃度調(diào)為3%，并根據(jù)術(shù)中大鼠對手術(shù)刺激的反應(yīng)，適當(dāng)調(diào)節(jié)濃度、流量以維持麻醉深度。將麻醉后大鼠四肢固定仰臥于手術(shù)板上，備皮消毒，暴露左側(cè)頸部，取頸前正中切口，切開頸部皮膚，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（Common carotid artery，CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈 （Internal carotid artery，ICA）、頸外動(dòng)脈 （External carotid artery，ECA）。用縫合線在左側(cè)ECA 遠(yuǎn)心端打一死結(jié)結(jié)扎ECA，動(dòng)脈夾夾閉ICA、ECA，雙極電凝器電凝ECA 分支，在 ECA 距 CCA 分叉 1 cm 處剪開一個(gè)小口，將線栓緩慢沿ECA 插入ICA，在剪口處向下約2 mm 處使用縫合線打一活結(jié)略微綁緊ECA，之后剪斷ECA 并將殘端反折以使線栓插入ICA，遇到輕微阻力時(shí)即停止插入，進(jìn)線深度為18~22 mm，再將ECA 殘端的活結(jié)打死防止線栓脫出。縫和傷口并消毒，2 h 后輕柔回抽線栓至CCA 分叉處，減去線栓的體外部分，實(shí)現(xiàn)再灌注損傷。假手術(shù)組只將頸部皮膚剪開，鈍性分離CCA、ICA、ECA 后即縫合，不予結(jié)扎和插線。保持室溫為25 ℃左右，直至大鼠蘇醒。

1.2.2 干預(yù)措施 電針組參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［4］選取大鼠“神庭”“百會(huì)”穴，選用華佗牌30 號(hào)0.5 寸不銹鋼毫針向上斜刺0.2~0.3 cm，連接SDZ-II 電針儀，電流設(shè)置1.5~2.0 mA，以針體輕微抖動(dòng)且大鼠耐受為度，選取疏密波，頻率2~5 Hz，每次20 min，術(shù)后24 h 開始進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)7 d。模型組和假手術(shù)組行同等條件抓取后回籠，不予治療。

1.3 標(biāo)本采集與檢測

1.3.1 神經(jīng)功能缺損評分 在手術(shù)后第1 天和第7 天對3 組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。大鼠蘇醒后，參照Zea-Longa 5 分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，判斷造模情況［5］。0 分：沒有神經(jīng)功能缺損；1分：未能完全伸展右側(cè)（患側(cè)）前爪，提示輕度神經(jīng)功能缺損；2 分：行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，提示中度神經(jīng)功能缺損；3 分：行走時(shí)向左側(cè)傾倒，提示重度神經(jīng)功能缺損；4 分：不能自主行走，并且意識(shí)水平較低。選取1~3 分的大鼠，剔除0 分和4 分大鼠。

1.3.2 TTC 染色觀察腦梗死狀況 電針干預(yù)結(jié)束后將大鼠稱重麻醉斷頭取腦，將新鮮腦組織置于-20 ℃冰箱2 h 變堅(jiān)硬后，放置于模具上進(jìn)行切片，每個(gè)腦組織切6 片，每片厚度約0.2 cm，將腦組織切片放入2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC） 溶 液中，避光放入37 ℃溫箱30 min，每隔5 min 翻動(dòng)1次，使每個(gè)面都能均勻染色。正常組織中的脫氫酶可將TTC 還原成紅色的三苯甲月替，故正常組織染色后呈紅色，而缺血組織中脫氫酶活性下降，染色后呈灰白色。

1.3.3 q-PCR檢測腦組織CACNα1DmRNA表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出大鼠海馬，放入RNA 保存液中，-80 ℃冰箱備用。參照Trizol 一步法說明提取總RNA，具體步驟為：組織樣品在液氮中研磨至粉末，立即加入1 mL Trizol，充分混勻裂解。加入200 μL 氯仿，用力充分振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。取上清，加入等體積氯酚仿，充分振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r/min 離心 10 min。取上清，加入等體積氯仿，充分振蕩混勻，4 ℃12 000 r/min離心10 min。取上清，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，-20 ℃沉淀 1 h。4 ℃ 12 000 r/min 離心 15 min。棄上清，加0.5 mL 75%乙醇，4 ℃8000~10 000 r/min離心5 min。重復(fù)上一步驟。棄上清后短暫離心，移液槍吸干乙醇，真空干燥2 min。加20 μL RNAFree water，室溫溶解5 min，混勻后短暫離心得到RNA 溶液。使用Fast Quantity RT Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，放入-80 ℃冰箱保存。引物序列見表1。q-PCR 反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積10 μL，其中上下游引物各 0.3 μL，cDNA 2 μL，q-PCR master Mix 5 μL，ddH2O 2.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性90 s；95 ℃變性 5 s；60 ℃復(fù)性 15 s；72 ℃延伸20 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本均設(shè)復(fù)孔，重復(fù)3 次，獲得 CACNα1D mRNA 基 因 Ct 值 ，以GAPDH 為內(nèi)參，按照 2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)。其中，△Ct=（目的基因平均 Ct-內(nèi)參平均 Ct）；△△Ct=（待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct），所有數(shù)據(jù)均與內(nèi)參比較。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表達(dá)，采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不符合正態(tài)分布使用秩和檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊使用Games Howen 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分

造模24 h 后，電針組和模型組神經(jīng)功能缺損評分均高于假手術(shù)組（P＜0.05），電針組和模型組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后7 d，電針組神經(jīng)功能缺損評分低于模型組（P＜0.05），模型組神經(jīng)功能缺損評分高于假手術(shù)組（P＜0.05），但電針組和假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2。

表2 3 組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 （分，x±s）

2.2 腦梗死面積觀察

假手術(shù)組腦切片基本呈現(xiàn)鮮紅色，模型組可見大面積灰白色梗死灶，電針組梗死灶面積明顯小于模型組。結(jié)果見圖1。

圖1 3 組大鼠腦梗死面積觀察

2.3 CACNα1D 在海馬中的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組CACNα1D mRNA表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，電針組CACNα1D mRNA 表達(dá)量明顯降低 P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表3、圖2。

表3 3 組大鼠海馬中CACNα1D mRNA 的表達(dá) （x±s）

圖2 3 組大鼠海馬中CACNα1D mRNA 的表達(dá)

3 討 論

既往研究表明，電針神庭、百會(huì)穴能夠有效改善 MCAO 大鼠的神經(jīng)功能狀況［6］。神庭、百會(huì)穴位于督脈上，與腦關(guān)系密切，《靈樞》中有督脈“入絡(luò)腦”的記載，另外，督脈為“陽脈之海”，人體陽氣足則氣化功能旺盛，生成氣血津液，使清陽得到充養(yǎng)，也能使氣血運(yùn)行正常，經(jīng)脈通暢，故歷代醫(yī)家有“病變在腦，首取督脈”的說法。根據(jù)現(xiàn)代研究表明，百會(huì)、神庭穴恰好位于與人的高級思維、記憶、精神密切相關(guān)的額、頂葉的投射區(qū)，針刺可引起神經(jīng)和骨膜效應(yīng)，影響和改善腦功能［7］。

鈣離子通過膜上鈣離子通透性通道，引起細(xì)胞內(nèi)外離子電位的不同，從而引起各種活動(dòng)。鈣離子通道廣泛存在于人體中，神經(jīng)元細(xì)胞中通過電壓依賴性鈣離子通道內(nèi)流的鈣離子是動(dòng)作電位誘導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放的關(guān)鍵［8］，CACNα1E 被證實(shí)能夠減少胰島素的分泌，增加患2 型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)［9］，CACNα1A 中的新型S218L 突變與家族性偏癱偏頭痛和輕度頭部外傷后延遲的致命性腦水腫和昏迷有關(guān)［10］。L 型鈣離子通道為高電壓激活通道，是由 α1S、α1C、α1D、α1F 幾個(gè)亞基特異形成的，其中 α1D 主要分布在大腦、心臟和內(nèi)分泌組織［11］，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用［12］。Veng LM 等［13］通過對比觀察年輕大鼠和老年大鼠的海馬發(fā)現(xiàn)，老年大鼠CACNα1D mRNA 的表達(dá)選擇性升高，這可能與CACNα1D mRNA 的表達(dá)上升后，通過L 型鈣通道內(nèi)流的鈣離子過多有關(guān)，而過量流入的鈣離子對記憶形成有害，因此推測L 型鈣離子通道的電流在與年齡有關(guān)的記憶衰退中起重要作用。Xu Jiehua 等［14］通過對大鼠腦組織進(jìn)行雙標(biāo)記熒光染色后發(fā)現(xiàn)CACNα1D與鈣結(jié)合蛋白在大腦中不同位置的協(xié)同定位表明其對神經(jīng)可塑性發(fā)揮重要作用并且兩者在脊髓背角II 層的共定位比例較高，說明傷害性傳遞的調(diào)節(jié)機(jī)制可能與L 型鈣離子通道和鈣結(jié)合蛋白有關(guān)。

在本研究中，模型組和電針組大鼠CACNα1D mRNA 表達(dá)量均高于假手術(shù)組，經(jīng)過電針干預(yù)后，電針組大鼠海馬中CACNα1D mRNA 表達(dá)較模型組明顯下降（P＜0.01），推測可能由于電針干預(yù)后抑制了CACNα1D mRNA 的表達(dá)，減少了鈣離子的流入，進(jìn)而影響動(dòng)作電位的生成，以及后續(xù)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。但由于腦卒中病理機(jī)制的復(fù)雜性和電針干預(yù)效果的多靶點(diǎn)特征，對于電針改善腦卒中癥狀的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。