HPLC 測定山西不同產(chǎn)地野生款冬花中款冬酮的含量

劉計權(quán)，張志芳，王亞君，王艷鳳

（山西中醫(yī)藥大學，山西晉中030619）

●中醫(yī)藥學在世界上首先發(fā)現(xiàn)了中藥并首創(chuàng)了方劑，醫(yī)方是“除疾 保性命之術(shù)”，而劑則有“調(diào)百藥齊，和之所宜”之功。采用現(xiàn)代藥物制劑技術(shù)重新研究并升華古典方劑之術(shù)，開創(chuàng)未來藥物制劑技術(shù)和新劑型藥物研究的全新思維和方向。

款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，每年12 月或地凍前當花尚未出土時采挖，除去花梗及泥沙，陰干入藥［1］。款冬花具有潤肺下氣、止咳化痰等功效，臨床上用于新久咳嗽、喘咳痰多、勞嗽咳血等，在中成藥生產(chǎn)中，款冬花又是通宣理肺丸、百花定喘丸等幾十種中成藥的重要原料［2］。

款冬花入藥始載于秦漢時期的《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，它的藥用價值、歷史淵源歷代醫(yī)家多有論述，除我國藥用外，歐美和北美洲均有以款冬的花蕾、花、葉和根治療咳嗽、感冒的記載［3］。

款冬花適應性極強，廣布于我國南北各省區(qū)，其中道地產(chǎn)區(qū)為河北、山西、陜西以及甘肅［4-5］。款冬花所含成分包括黃酮類、萜類、酚類、生物堿類等［6-7］，款冬酮是 2015 版《中國藥典》規(guī)定的指標性成分。

2009 年2 月，國家中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)（山西）基地建設(shè)規(guī)劃實施方案中將款冬花和連翹、苦參、黨參、黃芪、遠志、柴胡、山楂、酸棗仁列為山西重點發(fā)展的九大中藥材種植品種。2016 年6 月18日，“國家中藥標準化項目”正式在山西啟動，該項目將制定中藥材、中藥飲片、中成藥生產(chǎn)規(guī)范及標準，會上確定款冬花和連翹、苦參、黨參、黃芪、遠志、柴胡、山楂、酸棗仁為山西省承擔的“國家中藥標準化項目”中的九大中藥品種。

本研究采用HPLC 法，測定了山西不同產(chǎn)地野生款冬花中款冬酮的含量，以期為山西野生款冬花的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

日立高效液相色譜儀（Pump 5110；Auto sample 5210；Column oven 5310；Diode array detector 5430）［日立高新技術(shù)（上海） 國際貿(mào)易有限公司］、EX125ZH 電子天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司］、202A-1 電熱干燥箱（上海申光儀器儀表有限公司）、FW-200 高速萬能粉碎機（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、DZKW-4 雙孔電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、SCQ-140701P 超聲提取儀（上海聲彥超聲波儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物

款冬酮對照品（111884-201704）購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，乙醇，蒸餾水等。

野生款冬花藥材采自山西境內(nèi)13 個縣，經(jīng)鑒定均為菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾。款冬花藥材來源信息見表1。

表1 野生款冬花來源信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相采用甲醇-水溶液（85∶15）等度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；檢測波長220 nm，進樣量10 μL。對照品溶液和供試品溶液HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 款冬HLPC 色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取款冬酮對照品5.2 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至10 mL。精密吸取上述溶液1.0 mL 移入10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容至10 mL，搖勻，制成濃度為52 μg/mL 的款冬酮對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取款冬花藥材，除去花梗、泥沙等非藥用部分，在50 ℃烘箱中烘干至恒重。將烘干的藥材粉碎后過4 號篩，取過篩后的款冬花藥材粉末約1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入乙醇50 mL，稱定重量，浸泡30 min，回流提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取款冬酮對照品溶液 1、3、6、9、12 μL，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，款冬酮的回歸方程為y=2 631 856.73x-4617.38，r=0.9993。表明款冬酮在 0.52～6.24 μg 內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實驗

精密吸取款冬酮對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6 次，測定峰面積積分值，結(jié)果得RSD 為1.57%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取同一批款冬花供試品溶液，按2.1 項下色譜條件，分別于 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 進行測定，記錄款冬酮峰面積，求得RSD 為0.98%。結(jié)果表明供試樣品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性實驗

精密稱取同一批款冬花藥材粉末6 份，每份約1.0 g，精密稱定，按2.3 項下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件，依次進樣10 μL 進行測定，測得款冬花藥材中款冬酮的平均含量為1.06 mg/g，RSD 為1.28%，表明該實驗方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的同一批款冬花藥材粉末6 份，每份約0.5 g，于每份藥材粉末中分別加入濃度為0.52 mg/mL 的款冬酮對照品溶液1 mL，分別按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件依次進行測定，計算款冬酮的平均加樣回收率為98.03%，RSD 為1.56%，表明該方法的回收率良好。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實驗結(jié)果

2.9 樣品含量測定

將13 個產(chǎn)地的款冬花藥材按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件，分別取樣10 μL 注入高效液相色譜儀，測得峰面積值，根據(jù)線性方程計算款冬酮的含量。結(jié)果見表3。

由表中測定結(jié)果可知，不同產(chǎn)地野生款冬花藥材中款冬酮的含量不同，其中以五寨縣款冬花藥材中款冬酮的含量最高（1.64 mg/g），夏縣款冬花藥材中款冬酮的含量最低（0.73 mg/g）。2015 版中國藥典中規(guī)定，款冬花藥材中款冬酮的含量不得少于0.70 mg/g［1］，山西野生款冬花藥材中款冬酮的含量均符合藥典規(guī)定的標準。

表3 樣品含量測定結(jié)果

3 討 論

在供試品溶液的制備中，提前浸泡30 min，料液比為1∶20，比較了回流提取1 h 與超聲提取（功率200 W，頻率40 kHz）1 h 對款冬酮含量的影響，以回流提取法制備的供試品溶液中款冬酮的含量較高。在回流提取中，考察了 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 不同料液比對款冬酮含量測定結(jié)果的影響，其中以料液比為1∶50 回流提取制備供試品溶液中款冬酮的含量最高。最終確定款冬花藥材供試品溶液的制備方法為料液比為1∶50、提前浸泡30 min、回流提取1 h。

中藥材有效成分的形成、轉(zhuǎn)化與積累，受到環(huán)境條件的深刻影響，其中環(huán)境條件的影響主要與經(jīng)緯度、海拔高度、溫度、光照強度和土壤密切相關(guān)［8］。本研究在采集款冬花藥材的過程中發(fā)現(xiàn)，野生款冬花分布環(huán)境多樣，既有土層深厚、有機質(zhì)豐富的林下、山腳下，也有土壤貧瘠的路邊、河灘、砂礫，不同生境在經(jīng)緯度、海拔、土壤條件等方面存在一定的差異性，生境中共同的特點是土壤潮濕，所以土壤水分是影響其分布的重要因素。不同產(chǎn)地款冬花藥材中款冬酮含量的差異性是多種環(huán)境因子綜合作用的結(jié)果。