中華苦荬菜藥材的HPLC 指紋圖譜研究

李慧峰 ，孟 霜，曾桐春 ，李國艷 ，裴妙榮

（1.山西中醫藥大學，山西晉中030619； 2.山西中西醫結合醫院，山西太原030013）

中華苦荬菜又名山苦荬、苦菜、小苦苣菜等，為菊科苦荬菜屬（Ixeris）植物小苦苣菜［Ixeris chinensis（Thunb.）Nakai］的干燥全草。性寒味苦，分布廣泛，資源豐富，在我國大部分地區均有分布。中華苦荬菜具有清熱解毒、涼血消腫、活血破瘀、排膿收斂的功效。經研究發現其具有顯著的降血糖作用［1-5］。目前對中華苦荬菜藥材指紋圖譜研究未見文獻報道，故本研究采用高效液相色譜法建立中華苦荬菜的指紋圖譜分析方法，為有效控制中華苦荬菜藥材質量提供科學方法。

1 實驗材料

Waters 2695 高效液相色譜儀（美國沃特斯公司），Waters 2998 PAD 檢測器，Waters Empower 色譜工作站；HANGING FA2104 電子分析天平（上海精科天平儀器廠，精密度為萬分之一）；梅特勒AB135-S 電子分析天平（上海志榮電子科技有限公司，精密度為十萬分之一）；KQ3200E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

10 批中華苦荬菜藥材均采于山西太原、左權等地，經山西中醫藥大學中藥學院鑒定教研室裴香萍老師鑒定，鑒定結果：本品為菊科植物中華苦荬菜［Ixeris chinensis（Thunb.）Nakai］的干燥全草；木犀草苷對照品（批號：111720-201609，購于中國藥品生物制品檢定所）；甲醇為色譜純，乙醇、冰乙酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil （鉆石）C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相 A 為甲醇，B 為 0.5%冰醋酸水溶液，梯度洗脫條件見表1；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長 350 nm。

2.2 對照品溶液制備

取木犀草苷對照品適量，用十萬分之一分析天平精密稱定，加入甲醇制成1 mL 含54.3 μg 的溶液，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，即得。

表1 梯度洗脫條件

2.3 供試品溶液制備

取干燥的中華苦荬菜藥材粉末（過3 號篩）約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入體積分數為70%的乙醇50 mL，稱定質量，水浴加熱回流提取1 h，放冷，再次稱定質量，用70%的乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度考察 精密吸取同一份中華苦荬菜藥材供試品溶液10 μL，連續進樣6 次，記錄指紋色譜圖。以11 號峰木犀草苷為參照峰，計算并比較各色譜峰的相對保留時間、相對峰面積的一致性。結果表明，1～18 號共有指紋峰相對保留時間和相對峰面積積分值的RSD 為0.89%～2.97%，符合中藥指紋圖譜技術要求（RSD＜3%）。同時采用中藥色譜相似度評價軟件計算各色譜指紋圖譜的相似度，均大于0.99，表明實驗儀器穩定，精密度良好。

2.4.2 重復性考察 取同一批次中華苦荬菜平行6 份，分別按照2.3 項下方法制備供試品溶液，進樣，記錄指紋圖譜。以11 號峰木犀草苷為參照峰，計算并比較各色譜峰的相對保留時間及相對峰面積的一致性。結果表明1～18 號共有指紋峰相對保留時間及相對峰面積積分值的RSD 為0.02%～2.96%，符合中藥指紋圖譜技術要求（RSD＜3%）。同時采用中藥色譜相似度評價軟件計算各色譜指紋圖譜的相似度，均大于0.99，表明該方法的重復性良好。

2.4.3 穩定性考察 精密吸取同一份供試品溶液10 μL，分別于 0 h、2.5 h、5 h、7.5 h、10 h、15 h 進樣，記錄指紋色譜圖。以11 號峰木犀草苷為參照峰，計算并比較各色譜峰的相對保留時間及相對峰面積的一致性。結果表明1～18 號共有指紋峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 為0.01%～2.97%，符合指紋圖譜技術要求（RSD＜3%）。同時采用相似度評價軟件計算各色譜指紋圖譜的相似度均大于0.99，表明供試品溶液在15 h 內穩定。

2.5 指紋圖譜的建立

取10 批中華苦荬菜藥材樣品，分別精密稱取1 g，按照上述2.3 項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，得到10 批中華苦荬菜樣品的HPLC 指紋圖譜，結果見圖1。通過確認11 號峰為木犀草苷，其峰面積較大且較穩定，保留時間適中，故選擇此峰作為參照峰。將10 批藥材指紋圖譜導入采用藥典委員會推薦的指紋圖譜相似度評價軟件，進行色譜峰匹配，匹配結果見圖2，所得對照指紋圖譜見圖3。以2 號峰木犀草苷為參照峰，確定18 個共有峰為構成中華苦荬菜藥材的指紋圖譜的特征峰，樣品共有峰的相對保留時間及相對峰面積見表2、3。10 批供試品與對照指紋圖譜相似度計算結果分別為 0.943、0.994、0.952、0.958、0.996、0.919、0.998、0.939、0.976、0.980。

圖1 木犀草苷和樣品色譜圖

圖2 10 批中華苦荬菜藥材指紋色譜圖

圖3 對照指紋圖譜

3 討 論

本研究對提取方法、檢測波長、流動相系統進行了系統考察。采用二極管陣列檢測器對圖譜進行了全波長掃描，結果表明在350 nm 下的色譜基線平滑，譜圖特征性強，色譜信息較為豐富，故選用350 nm 作為測定波長。流動相條件選擇中分別考察了甲醇-0.2%磷酸水溶液和甲醇-0.5%冰醋酸水溶液兩種溶劑系統梯度洗脫，結果表明甲醇-0.5%冰醋酸水溶液系統的色譜峰分離效果好，色譜峰峰形對稱性較好，保留時間適中，更能全面反映樣品所含化學成分信息，故選甲醇-0.5%冰醋酸水溶液作為流動相。

表2 10 批中華苦荬菜藥材共有指紋峰的相對保留時間

表3 10 批中華苦荬菜藥材共有指紋峰的相對峰面積

本研究以木犀草苷為參照峰確定了中華苦荬菜的18 個共有峰，并通過相似度計算軟件得出10 批樣品相關性較好，色譜圖化學指紋信息完整，色譜峰分離度好，特征明顯，為中華苦荬菜藥材質量控制提供了科學依據。但由于中華苦荬菜藥材因產地及采收時間不同，所含成分的含量差異較大，且木犀草苷含量較高，致使其他成分的峰高相對較低，造成指紋圖譜中含量較少成分特征丟失，故有待進一步研究。