慢性疲勞綜合征孕鼠胎盤細胞增殖、凋亡情況及其分子機制探討

趙海 吳延軍 吳曙光 張健 姚剛

慢性疲勞綜合征（Chronic fatigue syndrome,CFS）是因生活節奏緊張而出現的一組以長期疲勞為突出表現的全身性癥候群，又稱肌痛性腦脊髓炎（Myalgic encephalomyelitis，ME），主要表現為睡眠障礙，常伴有體重、運動能力下降、免疫功能受損及腸道菌群失調等臨床癥狀[1]。流行病學調查結果顯示CFS 危及我國人口的10%～25%，患者的線粒體出現氧化應激，ATP 能量生成降低[2，3]。研究表明神經內分泌、免疫系統、氧化應激和遺傳因素等異常可誘導CFS 的發生，懷孕期、更年期和月經期等特殊時期會加重女性患者的臨床癥狀，同時妊娠女性胎盤提取物中的抗氧化、抗炎等生物活性物質也顯著降低[4～6]。

哺乳動物整個妊娠過程中子宮基質細胞蛻膜化、滋養層細胞侵襲遷移、胎盤細胞增殖凋亡、絨毛膜尿囊融合以及母胎血管重建等過程在胎盤形成進程中起到關鍵作用，胎盤發育異常與子宮內膜異位癥、子癇和妊娠高血壓等生殖性疾病息息相關[7]。目前研究發現采用復合刺激法復制的慢性疲勞綜合征雌性鼠的血清中雌、孕激素水平和學習記憶功能顯著降低，下丘腦-垂體-性腺軸功能紊亂，且其學習記憶功能降低[8～10]，進一步研究發現CFS 孕鼠胎盤形態結構存在異常。研究表明細胞增殖和凋亡、氧化應激穩態和FoxO 信號通路在胎盤的形成中起著重要作用[11～13]。CFS 孕鼠胎盤細胞增殖和凋亡情況、氧化應激穩態和FoxO 信號通路因子表達是否存在異常，它們之間與CFS 孕鼠胎盤結構異常是否有內在關聯，目前尚無相關報道。因此，本實驗擬通過免疫組化、TUNEL 和比色法檢測正常和CFS 孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤細胞增殖凋亡、氧化應激穩態以及D13 胎盤細胞中FoxO 信號通路因子表達情況，初步探討CFS 孕鼠胎盤的形態結構異常與胎盤細胞增殖凋亡、氧化應激穩態和FoxO 信號通路因子之間的關系，為闡明CFS 孕鼠胎盤結構異常，F1 代出現生長發育遲緩的分子機制奠定一定的理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑取SPF 級昆明小鼠，6～8 周齡，體重18.0～22.0g，共150 只，其中雌性100 只，雄性50只，由重慶醫科大學實驗動物中心提供[SCXK（渝）2012-0001]。

兔源性PCNA（bs-2006R）、FoxO-1（bs-2537R）和FoxO-4（bs-2766R）多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（C1091）購自碧云天生物技術有限公司；SP kit 兔源試劑盒（SP9001）、辣根酶標記抗山羊IgG（ZB2306）及DAB 顯色試劑盒（ZLI-9017）均購自北京中衫金橋有限公司；伊紅染液（D019-1）和蘇木素染液（D005-2）均購自南京建成生物工程研究所；氧化應激指標試劑盒活性氧（QY-X16254）、活性氮（QYY26312）和丙二醛（QY-Y23136），抗氧化應激指標試劑盒總抗氧化應激能力（QY-Y61124）、過氧化氫酶（QY-Y32512）、超氧化物歧化酶（QY-S13521）、谷胱甘肽過氧化物酶（QY-T11542）和過氧化物酶（QY-X35410）購自上海喬羽生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及復制CFS 小鼠模型 將SPF 級100 只雌性小鼠隨機分為正常組（不給予任何處理，n=50）和CFS 組（給予復合刺激，n=50）。每組孕鼠受孕時間點各10 只，從獲取的每個時間位點組織中隨機抽取9 個實驗樣本用于相應實驗研究。復合刺激包括實施束縛、力竭、夾尾、低溫、饑渴和明暗顛倒等處理，連續5 周，復制CFS 小鼠模型。

1.2.2 收集孕鼠血清、子宮及胎盤 CFS 小鼠模型復制成功后，采用摘除眼球法分別收集每組小鼠的血液，室溫靜置10min，離心，收集血清。此外脫臼處死每組小鼠各10 只，收集子宮。采用雄鼠與動情期雌鼠1：2 合籠，次日早上9:00 觀察到陰栓者記為妊娠第1 天（記為D1），收集D8、D10、D12、D13 和D14 的胎盤組織，采用預冷的PBS 洗滌2 次，4%多聚甲醛固定24h 后，經梯度酒精脫水、常規石蠟包埋和切片。隨后采用IHC 和比色法進行細胞增殖、凋亡、氧化應激和FoxO 相關指標的檢測。

1.2.3 免疫組化 免疫組化步驟按北京中山金橋公司生產的SP 免疫組化染色試劑盒說明書進行。孕鼠D8、D10、D12、D13 和D14 植入位點石蠟切片（5 μm），切片進行脫蠟，復水，枸櫞酸溶液抗原修復，山羊血清封閉，兔源性PCNA（1∶500 稀釋）、FoxO-1（1∶400稀釋）和FoxO-4（1∶400 稀釋）的多克隆抗體，4℃孵育過夜，次日分別加入山羊抗兔的二抗，滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液（S-A/HRP）室溫孵育30min，DAB 顯色，蘇木精復染，封片，顯微鏡下觀察D8、D10、D12 和D14 胎盤細胞PCNA 的表達，以及D13 胎盤細胞中FoxO-1 和FoxO-4 的表達情況。

1.2.4 比色法 比色法檢測血清、子宮和孕鼠D13 胎盤組織中氧化應激和抗氧化應激指標含量，取出凍存的子宮和胎盤組織，采用勻漿機進行勻漿，過濾，收集濾液。將血清、子宮和胎盤的濾液分別加入96孔板內，分別設為測試的樣品和空白組，每個孔重復3 次。隨后向空白每孔添加50μl 試劑SinoBestBio緩沖液A，向待測樣品孔內分別加入50μl 試劑SinoBestBio 染色液B。輕輕搖動96 孔板，使其混勻。放進 37℃培養箱里孵育30min，即刻放進酶標儀里，于580nm 波長處讀取吸光度值（OD），根據吸光度值構建生成曲線，計算樣品實際濃度。

1.2.5 TUNEL 將D8、D10、D12 和D14 的石蠟切片進行二甲苯脫蠟5～10min。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10min。無水乙醇5min。90%乙醇2min，70%乙醇2min，蒸餾水2min，滴加20μg/ml 不含DNase的蛋白酶K（20mg/ml），用P0106 免疫染色洗滌液37℃作用20min，PBS 洗滌3 次。滴加50μl 的生物素標記液（按照說明書進行配制），37℃避光孵育60min。用PBS 洗滌1 次，滴加0.1～0.3ml 標記反應終止液，室溫孵育10min。用PBS 洗滌3 次，滴加0.5ml DAB 顯色液（按照說明書進行配制DAB 顯色液），室溫孵育5～30min 或根據顯色情況孵育適當時間。用PBS 洗滌3 次終止染色，隨后采用蘇木素染色液進行細胞核染色。再用PBS 洗滌3 次，用梯度乙醇進行脫水，二甲苯透明封片，顯微鏡下觀察孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤細胞凋亡情況。

1.3 統計學分析采用SPSS 17.0 軟件，運用單因素方差分析法（ANOVA）比較PCNA、FoxO-1、FoxO-4和TUNEL 陽性細胞在不同組份胎盤中表達的差異性，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CFS 孕鼠胎盤細胞增殖情況免疫組化實驗檢測胎盤細胞增殖情況，實驗結果顯示與正常組比較，CFS 組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤中增殖細胞核抗原表達呈逐漸降低趨勢，見圖1。Image Pro Plus圖像分析顯示，PCNA 在CFS 孕鼠D8 和D12 胎盤中陽性細胞的IOD 值與正常組比較，無統計學差異（P＞0.05），但PCNA 在D10 和D14 胎盤中陽性細胞的IOD 值顯著低于正常組（P＜0.05），見表1。

圖1 兩組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤細胞增殖情況（×400）

表1 PCNA 在兩組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤細胞中陽性細胞IOD 值比較（）

表1 PCNA 在兩組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤細胞中陽性細胞IOD 值比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05

2.2 CFS 孕鼠胎盤細胞凋亡情況采用TUNEL 法檢測胎盤細胞凋亡情況，實驗結果顯示，與正常組比較，隨著妊娠天數的增加，CFS 組D8、D10、D12和D14 胎盤蛻膜區中細胞凋亡呈逐漸增加趨勢，見圖2。Image Pro Plus 圖像分析顯示，CFS 組孕鼠D8胎盤蛻膜區中陽性凋亡細胞的IOD 值與正常組無統計學差異（P＞0.05），CFS 組D10、D12、D14 胎盤細胞蛻膜區中凋亡陽性細胞的IOD 值顯著高于正常組（P＜0.05），見表2。

表2 凋亡細胞在兩組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤蛻膜區細胞中陽性細胞IOD 值比較（）

表2 凋亡細胞在兩組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤蛻膜區細胞中陽性細胞IOD 值比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05

圖2 兩組孕鼠D8、D10、D12 和D14 胎盤細胞凋亡情況（×400）

2.3 CFS 孕鼠胎盤氧化應激穩態受損采用比色法檢測兩組小鼠血清、子宮和孕鼠D13 氧化應激與抗氧化應激指標表達情況，實驗結果顯示，CFS組小鼠血清、子宮和孕鼠D13 胎盤中氧化應激指標活性氧、活性氮和丙二醛的含量均顯著高于正常組（P＜0.05）。CFS 組小鼠血清、子宮和孕鼠D13胎盤中抗氧化應激指標總抗氧化應激能力、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物酶的含量均顯著低于正常組（P＜0.05），見表3。

2.4 CFS 孕鼠胎盤FoxO 信號表達增強免疫組化實驗結果顯示FoxO 信號通路中指標FoxO-1 和FoxO-4 在CFS 孕鼠D13 胎盤迷路區中的表達均強于正常組，見圖3。Image Pro Plus 圖像分析顯示，FoxO-1 和FoxO-4 在CFS 孕鼠D13 胎盤中陽性細胞的IOD 值顯著高于正常組（P＜0.05），見表4。

表3 兩組小鼠血清、子宮和孕鼠D13 胎盤中氧化應激和抗氧化應激指標表達情況

圖3 FoxO-1 和FoxO-4 在兩組孕鼠D13 胎盤中的表達情況（×400）

表4 FoxO-1 和FoxO-4 在兩組孕鼠D13 胎盤細胞中陽性細胞的IOD 值比較（）

表4 FoxO-1 和FoxO-4 在兩組孕鼠D13 胎盤細胞中陽性細胞的IOD 值比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05

3 討論

慢性疲勞綜合征已成為21 世紀影響人類身心健康的新殺手，給患者的工作和家庭帶來很大困擾，在英國CFS 的發病率為0.19%，美國男性CFS發病率為2.3%，女性為1.9%，日本CFS 的發病率為1.5%，中國中學生的發病率為0.9%。CFS 與高壓力的生活狀態有關，隨著人們生活節奏的加快、生活壓力的增加，CFS 的發病率也越來越高，對生活質量產生了嚴重影響[14]。CFS 發病機制與病毒感染、能量代謝、大腦功能、精神心理因素、免疫系統功能、遺傳易感性和神經內分泌系統等密切相關[15，16]。流行病學調查發現女性患者的月經不調、子宮內膜異位癥、盆腔疼痛等婦科問題風險指標和性功能障礙發病率明顯增高[17,18]。CFS 患者產科疾病的臨床表現和分子機制研究成為目前生殖領域研究的熱點。

哺乳動物胎盤不僅是母胎氣體營養物質交換和胎兒代謝物排泄的場所，同時也是一個重要的內分泌器官。胎盤發育異常將導致自然流產、先兆子癇、宮內發育遲緩（intrauterine growth retardation,IUGR）和葡萄胎等妊娠性疾病的發生發展[19，20]。研究表明胎盤的形成與氧化應激穩態、FoxO、Tead 和Wnt等信號通路密切相關[21]。近年研究發現，氧化應激是導致多種疾病的主要因素，氧化應激相關指標與子癇前期、妊娠高血壓及妊娠期糖尿病（GDM）等妊娠特有疾病密切相關[22～24]。氧化應激可加快胎盤滋養細胞的凋亡老化，進而影響滋養細胞的合體化、向浸潤方向的分化和子宮螺旋動脈重塑，加劇胎盤缺氧狀態形成的惡性循環，誘發病理妊娠[25]。氧化應激可以通過增加促炎因子、線粒體損傷及下游基因表達參與胎盤細胞增殖凋亡、侵襲遷移和血管生成等進程，致使胎盤功能障礙[26，27]。氧化應激可造成人滋養細胞氧化損傷，增殖和侵襲能力下降，致使胎盤發育異常[28]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）可能通過誘導胎盤滋養細胞的凋亡參與子癇前期的發生[29]。

FoxO 屬于叉頭框蛋白（Forkhead proteins）家族，其成員包括FoxO-1、FoxO-3、FoxO-4 和FoxO-6，研究表明FoxO 家族信號參與轉錄、激活、抑制多個靶基因，參與調控動物的生長發育、代謝、細胞周期、增殖凋亡、自噬、炎癥、氧化應激、抑制腫瘤等[30～32]。研究表明FoxO-4、FoxO-1 和FoxO-3a 的過量表達可誘導細胞增殖停滯，促進凋亡[33]。此外FoxO 還參與胎盤的發育進程，FoxO 是保護母胎免受氧化損傷的關鍵因子[34]。氧化應激可以通過調控Wnt/β-catenin 信號因子影響胎盤滋養細胞的侵襲遷移，從而參與胎盤的形成[35]。FoxO-3a 在早孕小鼠子宮內膜蛻膜化中起著關鍵作用，FoxO-1 可調節絨毛滋養層細胞JAR 的增殖和遷移，胎盤FoxO-1過度表達可能參與妊娠期糖尿病胰島素抵抗的發生發展[36，37]。由此可見氧化應激和FoxO 信號通路共同參與調控胎盤的形成。

本實驗通過采用免疫組化和TUNEL 方法檢測不同妊娠時期CFS 孕鼠胎盤增殖和凋亡情況，同時檢測氧化應激指標和FoxO 信號因子的表達情況，探討CFS 孕鼠胎盤形態結構異常的分子機制。實驗結果顯示，PCNA 在CFS 孕鼠D8 和D12胎盤中陽性細胞的IOD 值與正常組無顯著性差異，但PCNA 在D10 和D14 胎盤迷路區中陽性細胞的IOD 值顯著低于正常組（P＜0.05）。與此同時CFS組小鼠D10、D12 和D14 胎盤細胞蛻膜區中凋亡陽性細胞的IOD 值顯著高于正常組（P＜0.05），由此推測CFS 孕鼠胎盤增殖降低、凋亡增加可能致使胎盤結構異常，但其具體的分子機制有待深入研究。

本研究采用比色法和免疫組化檢測兩組孕鼠D13 胎盤氧化應激與抗氧化應激指標及FoxO 信號表達情況，實驗結果顯示，CFS 小鼠血清、子宮和孕鼠D13 胎盤中氧化應激指標含量均顯著高于正常組（P＜0.01）；CFS 小鼠血清、子宮和孕鼠D13 胎盤中抗氧化應激指標含量均顯著低于正常組（P＜0.01）。免疫組化實驗結果顯示FoxO 信號通路中指標FoxO-1 和FoxO-4 在CFS 孕鼠D13 胎盤迷路區中的表達量均顯著高于正常組（P＜0.05）。據此，推測孕鼠FoxO 信號表達異常，胎盤抗氧化能力降低，致使胎盤增殖降低、凋亡增加，誘導胎盤結構異常，最終導致CFS 孕鼠F1 代生長發育緩慢，本實驗以期為CFS 女性患者的妊娠疾病治療提供新的實驗基礎和理論依據。