補腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細胞TGF-β的作用研究

王春霞 岳師師 毛炎佳 姜亞茹 劉玉春 燕莎 李永偉

卵泡的生長發育受下丘腦-垂體-卵巢性腺軸的調控及其相關組織分泌激素的調節，從卵泡的生成到卵子的排出，任何一個環節出現問題均可導致排卵障礙[1]。TGF-β超家族的一個亞型TGF-β1及其受體TGF-β1R 在卵巢不同發育階段中均可表達[2]。補腎助孕顆粒是王春霞教授在長期臨床實踐中的經驗方，通過多年臨床觀察對于恢復月經周期，促進排卵具有良好的效果，且臨床觀察中未發現并發癥及副作用[3]。為了解該方對卵泡生長發育的作用，我們用大鼠卵巢顆粒細胞進行實驗研究，觀察其對TGF-β1及受體濃度變化并進行分析，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞大鼠卵巢顆粒細胞購自武漢原生原代生物醫藥科技有限公司，產品編號：RATCELL-0077，規格：5×105cells/ml。

1.2 實驗用藥與耗材補腎助孕顆粒（菟絲子，規格：10g/袋，批號:1905006C；當歸，規格：10g/袋，批號:1906013C；枸杞子，規格：5g/袋,批號:1906001C；熟地，規格：10g/袋,批號:1905004W；制何首烏，規格：10g/袋,批號:1812003C；白芍，規格：10g/袋,批號:1906001W；川芎，規格：6g/袋,批號:1906003C；黃芪，規格：10g/袋,批號:1907001W；炙淫羊藿，規格：10g/袋，批號:1901002C；山藥，規格：10g/袋，批號:1904006W；牛膝，規格：5g/袋，批號:1906001C）廠家：三九制藥。注射用尿促性素針（HMG），廠家：麗珠集團麗珠制藥廠，規格:75U，批號:180504。細胞培養基：批號:0012519，廠家:BI 生物公司。牛血清：批號：1924622，廠家：BI 生物公司。大鼠TGF-β1 試劑盒，批號：201812，上海江萊生物科技公司。大鼠TGF-β1R 試劑盒，批號：201812，上海江萊生物科技公司。

1.3 實驗分組選擇生長良好的大鼠卵巢顆粒細胞，用細胞計數板進行計數，調整細胞為1×105cells/ml，用96 孔細胞培養板進行培養，并分為對照組（空白）、高劑量組（含生藥3.24g/ml）、中劑量組（含生藥1.62g/ml）、低劑量組（含生藥0.81g/ml）、HMG 組（陽性對照組），每組18 孔，37℃ 5%CO2進行培養，分別在1、6、12、24、48h 離心取培養物上清液，按大鼠TGF-β1 及受體試劑盒操作說明書進行程序設定，用艾德康全自動酶聯免疫一體機進行檢測，用試劑盒自帶標準液繪制曲線進行測定。

1.4 統計學方法采用SPSS 17.0 軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（）表示，采用t檢驗。計數資料以率（%）表示，采用卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同含量補腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細胞TGF-β1 表達量的影響對照組各個時間點TGF-β1 的濃度變化無差異（P＞0.05）；除HMG 組，其他各中藥組12h 濃度最高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；中劑量組用藥12h TGF-β1 的濃度高于高劑量組和低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）；HMG 組用藥6h TGF-β1 濃度最高，與其他時間點相比差異有統計學意義（P＜0.05）。中劑量組用藥12h 與HMG 組用藥6h TGF-β1 濃度相比差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 不同含量補腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細胞TGF-β1R 表達量的影響對照組各個時間點TGF-β1R 的濃度變化無差異（P＞0.05）；除HMG組其他各中藥組12h 濃度最高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；中劑量組用藥12h TGF-β1R 的濃度高于高劑量組和低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）；HMG 組用藥6h TGF-β1R 最高，與其他時間點相比差異有統計學意義（P＜0.05）。中劑量組用藥12h 與HMG 組用藥6h TGF-β1R 濃度相比差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 不同含量補腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細胞TGF-β1 表達量的影響情況（，ng/L）

表1 不同含量補腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細胞TGF-β1 表達量的影響情況（，ng/L）

表2 不同含量補腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細胞TGF-β1R 表達量的影響情況（，ng/L）

表2 不同含量補腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細胞TGF-β1R 表達量的影響情況（，ng/L）

3 討論

《內經》腎藏精，主生殖，是對人體的生殖功能的高度概括，腎中之精又有先天之精和后天之精，先天之精得到后天之精的濡養得以升華，為腎主生殖的根本[4]。《靈樞·經脈篇》曰“人始生,先成精”。腎中精氣是孕育的物質基礎，精氣的充盈與女性卵泡的生成、發育、成熟密切相關[5]。隨著高科技的發展，人們生活節奏的加快，女性承擔的壓力也隨之增大，直接影響到了女性生殖及內分泌功能[6]，出現卵巢早衰、多囊卵巢綜合征、閉經、異常子宮出血等疾病的增多，從而影響到女性卵泡的發育、成熟及排出，造成女性不孕癥的增多[7]。現代研究發現補腎藥物具有類激素樣的作用，起到改善女性內分泌的功能，促進卵泡的發育與排出[8]。

補腎助孕顆粒是王春霞教授多年臨床觀察總結出來的對排卵障礙性不孕癥治療的有效方劑，具有補腎填精調經助孕之功[9，10]。補腎助孕顆粒中熟地、菟絲子能夠補腎填精；制何首烏、枸杞子和當歸能夠滋陰補血；白芍能夠養血調經；山藥、黃芪能夠益氣補血；川芎能夠行氣活血；牛膝能夠引血下行；配以炙淫羊藿起到陽中求陰功效。方中的活血化瘀藥能改善卵巢微循環，且促進卵泡發育及排卵。方中的補腎藥能夠增強卵巢和垂體的功能，起到調節內分泌的功能。

TGF-β 是一個龐大的家族，主要以TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 為主，參與許多細胞生長過程，包括細胞增殖、分化、遷移和存活，其在胚胎發育中也起著重要作用，其中TGF-β1 的活性最強，功能也最多，臨床應用最廣泛[11]。活化后TGF-β1 分子量為25Kd，含有112 個氨基酸，由2 條單鏈組成[12]，TGF-β1 常與其相應受體結合后發揮作用，其在哺乳動物卵巢中主要表達于卵母細胞，促進卵泡的生長發育和卵子的成熟。我們通過實驗研究發現，在應用促性腺激素和補腎助孕顆粒都可引起TGF-β1 及其受體在卵泡發育的不同階段進行表達，對照組各個時間點TGF-β1 及其受體的濃度變化無差異；補腎助孕顆粒各劑量組用藥后TGF-β1 及其受體的濃度均高于對照組，以給藥后12h 濃度最高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；中劑量組用藥12h TGF-β1 及其受體的濃度高于高劑量組和低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）；HMG 組用藥6h TGF-β1 及其受體濃度最高，與其他時間點相比差異顯著（P＜0.05）。中劑量組用藥12h 與HMG 組用藥6h TGF-β1 及其受體濃度相比差異無統計學意義。所以，促性腺激素和補腎助孕顆粒在卵泡生長發育過程中都能起到促進作用。本研究為補腎助孕顆粒在女性排卵障礙性不孕癥的治療方面提供了實驗依據和理論支持。