不同價態的陰離子在DNA凝聚效應中的抑制作用

李聰聰，楊光參，王艷偉

(溫州大學 數理學院，浙江 溫州 325035)

DNA是一種攜帶大量負電荷的長鏈有機聚合物，在極性溶液中，DNA分子會水解，其堿基對帶負電，當溶液中有陽離子時，DNA周圍會匯聚很多帶正電的抗衡離子，即陽離子與DNA表面負電荷相結合，此時DNA表面的負電荷會被中和，當DNA表面電荷被中和達到89%時，DNA凝聚就會發生[1-2]。DNA的許多凝聚劑，如金屬陽離子[3-4]、堿性蛋白質[5-6]、多胺類[7-8]以及一些中性聚合物[9-10]和金屬混合物[11]都能使DNA產生凝聚或者縮合。

目前關于陽離子導致DNA凝聚的研究非常多，為科研乃至基因治療領域提供了極佳的理論基礎。在細胞中，帶負電的DNA被限制在一個很小的空間中，這個空間包含的很多陽離子和陰離子維持了這個小系統的平衡。細胞中的三磷酸腺苷和二磷酸腺苷都為攜帶負電荷的陰離子，其對DNA的作用還未可知。在研究陽離子對DNA凝聚的過程中也會引入陰離子，因此陰離子對DNA的作用顯得不可忽略。Saito等[12]，Yoshikawa等[13-14]用熒光顯微鏡對DNA的單分子觀察發現，單個DNA鏈在凝聚中經歷了一個大的離散型轉變，具有高價態的陰離子會使DNA變成線圈態而不是凝聚態。將這種轉變歸因于DNA表面離子對的形成，在多價態陰離子存在時，由于其大的帶電量，導致溶液中更多的陽離子與其形成離子對而不能結合在DNA表面繼而影響DNA凝聚過程。Duc等[15]用Monte Carlo模擬方法證明在有陰離子的情況下，DNA 凝聚層表面的負電荷濃度略高導致了DNA過度充電的顯著減少。龔紅玲[16]利用等溫滴定量熱法定量研究DNA凝聚過程中溫度效應及離子濃度效應，用NaCl，NaF，Na2SO4，Na3PO4作用于精胺導致的DNA凝聚，結果發現精胺與DNA的結合常數從左到右依次逐漸減小，這表明陰離子對陽離子介導DNA 凝聚有抑制作用，而且抑制凝聚能力由大到小依次為PO43-，SO42-，F-，Cl-。蔣楊偉[17]依托分子動力學方法研究了粗粒化模型下雙鏈DNA與帶正電樹枝狀分子復合物的相變行為,證明高價態陰離子的加入改變了DNA樹枝狀分子周圍的電荷空間分布，削弱了雙鏈DNA與樹枝狀分子的靜電相互作用，樹枝狀分子表層的電荷反轉引發了DNA與樹枝狀分子的吸附/解吸轉變。

雖然前人已經做了大量關于陰離子對DNA凝聚影響的研究，但大都依賴于計算機模擬，并沒有通過實驗直觀地反映出陰離子作用的DNA的形貌的變化以及DNA表面電荷的中和情況。本文通過動態光散射(dynamic light scattering，DLS)和原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)技術，定量地研究了不同價態陰離子對陽離子中和DNA表面電荷的影響和對陽離子介導的DNA凝聚形貌的影響。結果表明，陰離子可以抑制DNA的凝聚，而且價態越高，抑制作用越強。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器

Zetasizer nano ZS90 動態光散射裝置(英國Malvern Instrument Ltd)；Malvern DTS1070樣品池(英國Malvern Instrument Ltd.)；NanoWizard Ⅲ原子力顯微鏡(德國 JPK instrument AG公司)；NCHR-50原子力探針(瑞士Nano World公司)。實驗清洗儀器和配置藥品的超純水從Milli-Q純水機(Millipore，Billerica，MA，USA)獲得。

1.2 實驗材料

雙鏈λ-DNA(英國New England Biolabs)；TRIS (hydhoxymethy) aminomethane，氯化精胺(C10H24N4Cl4)，氯化鈉(NaCl)，六水合氯化鎂(MgCl2·6H2O)購自美國Sigma-aldrich公司，純度>99%，無需進一步純化即可使用。無水硫酸鈉(Na2SO4)、檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O)、無水硫酸鎂(MgSO4)、檸檬酸鎂(C12H10Mg3O14)購自上海麥克林生化有限公司，純度> 99%。濃度為10 mmol/L的TRIS緩沖液用作配置藥品的原液和DNA的緩沖液。所有測量至少重復兩次以獲得一致的結果。在實驗中所用到的材料還有載玻片、離心管、注射器、槍頭、云母、培養皿等。

2 實驗原理與方法

2.1 動態光散射裝置

DLS通過樣品池可測量樣品的電泳遷移率，所謂的電泳意味著聚電解質在施加電場的情況下沿著與正電荷相反的方向轉移，同介質中的平衡離子作相對運動的現象。動態光散射是通過測量物質被光照后出現的散射光的各項參數變化來研究粒子的大小和帶電情況的[18]，具有測量有效率高、可重復性好、準確度高等優點。動態光散射測量裝置如圖1所示。

圖1 動態光散射裝置結構示意圖Fig.1 Diagram of dynamic light scattering

其相關測量原理如下：

(1)

其中f(κr)是κr的函數， 稱為Henry函數，r是粒子半徑，1/κ是德拜長度；η為介質的黏度系數；ζ是Zeta電勢，ε是介質的介電常數。利用DLS技術，被測粒子的Zeta電位將直接被測得，通過式(1)就能算得被測粒子的電泳遷移率。DLS技術廣泛地應用于研究DNA與平衡離子之間的相互作用。

2.2 原子力顯微鏡

本實驗使用的AFM其內部設有自動機器人和一架控制裝置，還有一個BioScience溫控系統和NanoScience系統(圖2)。AFM的組成部分有檢測系統、光電檢測器、掃描系統、探針、反饋控制系統。基本成像模式有接觸成像模式、非接觸成像模式、輕敲模式。原子力顯微鏡成像是通過一個非常尖銳的尖端掃描樣品表面，而尖端和樣品之間相互作用的力則是通過皮牛級力的靈敏度來監測的。樣品被安裝在壓電掃描器上，該掃描器可確保高分辨率的三維定位，并且通過使用光學方法(激光、光電二極管)測量懸臂梁撓度來監測尖端和表面之間的力[19]。

圖2 激光檢測原子力顯微鏡探針工作示意圖Fig.2 Laser detection of the AFM probe

2.3 樣品制備

2.3.1 動態光散射實驗樣品制備

用TRIS緩沖液將待測藥品分別稀釋為不同濃度比例，然后各取1000 μL到不同的離心管中，再依次向溶液中加2 μL-DNA，放在微型旋轉儀上等待20～30 min后，將其注入Zeta樣品池中，放入DLS中進行實驗。每次測試完后，將樣品池中溶液倒掉，更換不同濃度的溶液前，用注射器抽取去離子水沖洗至少3次，以免影響實驗結果精度。

2.3.2 原子力顯微鏡實驗樣品制作

用雙面膠將邊長約1 cm的小正方形云母片貼在載玻片的中心，之后使用磨砂膠帶貼在云母片上逐層撕去直到得到表面平整的樣品。取20 μL待測混合溶液滴在云母片上，靜置3～5 min后用移液器緩緩從一角吸走余液，然后取30 μL去離子水清洗殘留藥品，如此清洗10～12次，最后用氮氣吹干并將樣品放入干凈的培養皿中。實驗樣品詳細制備步驟如圖3所示。

圖3 原子力顯微鏡樣品制備步驟示意圖Fig.3 Procedure of sample preparation for AFM

3 實驗結果

3.1 不同價態陰離子對DNA表面電荷中和的影響

為了研究不同價態陰離子對陽離子中和DNA表面電荷過程的影響，在DLS實驗中用Cl-，SO42-，C6H5O73-作為陰離子，同時也有Na+或Mg2+存在溶液中，由于一價陽離子和二價陽離子都不能使DNA電荷逆轉，所以我們給每組溶液中加入了0.05 mmol/L含四價陽離子的氯化精胺(C10H24N4Cl4)作為DNA凝聚劑，查看DNA在不同價態陰離子下的電泳遷移率(圖4)。圖4中NaCl濃度從左至右依次為3，6，9，12，15，18 mmol/L,Na2SO4濃度從左至右依次為1.5，3，4.5，6，7.5，9 mmol/L,Na3C6H5O7濃度從左至右依次為1，2，3，4，5，6 mmol/L。由圖4可以看出，NaCl的電泳遷移率總是大于Na2SO4，而Na3C6H5O7在各點都是處于最小值。圖5是將溶液中的單價鈉鹽改為二價鎂鹽所得的各種混合溶液的DNA電泳遷移率。其中每組溶液仍加入0.05 mmol/L C10H24N4Cl4作為DNA凝聚劑，圖5中MgCl2濃度從左至右依次為1.5，3，4.5，6，7.5，9 mmol/L，MgSO4濃度從左至右依次為1.5，3，4.5，6，7.5，9 mmol/L，Mg3(C6H5O7)2濃度從左至右依次為0.5，1，1.5，2，2.5，3 mmol/L。在圖中看到相同陽離子濃度下，MgCl2的電泳遷移率總是大于MgSO4，而Mg3(C6H5O7)2在各點都是處于最小值。圖4、圖5均表明價態越高的陰離子對DNA表面電荷的中和作用抑制越強，可以看出隨著單價鹽和二價鹽濃度的增加，混合物溶液的電泳遷移率都在緩慢升高，但是始終沒有使DNA電荷逆轉。

圖4 0.05 mmol/L C10H24N4Cl4與含有不同價態陰離子的單價鹽溶液對DNA電泳遷移率的影響Fig.4 Effects of 0.05 mmol/L C10H24N4Cl4 and monovalent salt solution containing anions of different valencies on DNA electrophoretic mobility

圖5 0.05 mmol/L C10H24N4Cl4與含有不同價態陰離子的二價鹽溶液對DNA電泳遷移率的影響Fig.5 Effects of 0.05 mmol/L C10H24N4Cl4 and divalent salt solution containing anions of different valencies on DNA electrophoretic mobility

3.2 在不同價態陰離子存在下，陽離子與DNA復合物形態的AFM成像

由3.1節可見，陰離子可以使氯化精胺導致的DNA的電泳遷移率變小，對DNA的電荷中和有抑制作用，而且陰離子價態越高，對電泳遷移率的抑制作用越強。實驗中改變陽離子種類但控制相同的陽離子濃度，發現陰離子對DNA的電荷中和有同樣的抑制作用，而且也是有相同的趨勢。為了進一步分析陰離子對DNA凝聚作用的影響，通過AFM觀察了在不同價態陰離子下DNA凝聚體的形貌圖。同樣地，用氯化精胺作為DNA凝聚劑，引入Cl-，SO42-，C6H5O73-作不同價態的陰離子，同時引入了Na+或者Mg2+。不同價態陰離子在單價鹽溶液中對DNA- C10H24N4Cl4作用后的形態如圖6(b)～6(d)所示，圖6(a)作為對照只加入了0.01 mmol/L C10H24N4Cl4。圖6(b)～6(d)中對應的溶液分別為60 mmol/L NaCl，30 mmol/L Na2SO4，20 mmol/L Na3C6H5O，都加入0.01 mmol/L C10H24N4Cl4。從圖6(a)可以看出，當只加入0.01 mmol/L C10H24N4Cl4時，DNA開始縮合呈現為即將凝聚的狀態。而在圖6(b)中DNA的凝聚形態變化也不是很大，可見60 mmol/L NaCl對DNA的凝聚形態影響很小；當在圖6(a)的基礎上加入30 mmol/L Na2SO4時，AFM形態如圖6(c)所示，盡管DNA已經凝聚，但凝聚程度沒有圖6(a)強;圖6(d)顯示結果為DNA凝聚現象更弱。可見在相同Na+濃度下，高價陰離子相對低價陰離子，對DNA凝聚的抑制作用更強，使DNA的凝聚形態變得更加松散，進一步證實了有陰離子存在下，陽離子導致的DNA凝聚效果會減弱。

圖6 不同陰離子存在下C10H24N4Cl4和 Na+ 導致的DNA凝聚AFM圖像Fig.6 AFM images of DNA condensation induced by C10H24N4 Cl4 and Mg2+ in the present of different co-ions

同樣，將帶有不同價態陰離子的二價鹽加入0.01 mmol/L C10H24N4Cl4-DNA中，AFM測得的DNA形態如圖7所示，圖7(a)～7(c)中對應的化合物濃度分別為27 mmol/L MgCl2，27 mmol/L MgSO4，9 mmol/L C12H10Mg3O14，然后在每種溶液中都加入0.01 mmol/L C10H24N4Cl4。圖7(a)與圖6(a)相比，DNA從花狀結構變成了網狀形態，說明DNA- C10H24N4CL4復合物在加入Mg2+后會促進凝聚，凝聚效果更明顯，主要原因是二價陽離子存在后，可作為云母連接DNA的橋梁，從而使多價陽離子更好地起到凝聚的效果；相對于圖7(a)，圖7(b)DNA凝聚作用有稍微減弱；圖7(c)相對于圖7(b)的DNA凝聚作用變得更弱，說明在陰離子存在下，濃度相同的二價陽離子與精氨離子共同作用的DNA凝聚程度會降低，并且陰離子價態越高，對DNA凝聚程度的抑制作用越大。

圖7 不同陰離子存在下C10H24N4Cl4和Mg2+ 導致的DNA凝聚AFM圖像Fig.7 AFM images of DNA condensation induced by C10H24N4 Cl4 and Mg2+ in the present of different co-ions

4 結論

本文通過動態光散射和原子力顯微鏡實驗研究了DNA的電泳遷移率變化和DNA形貌的變化，較為系統地證明了在單價或者二價陽離子與C10H24N4Cl4存在下陰離子對DNA凝聚作用的影響。結果表明，陰離子阻礙了陽離子中和DNA表面電荷的過程，并且抑制了DNA的凝聚。原因是溶液中的陰離子會結合陽離子形成離子對，與低價的陰離子相比，高價的陰離子在DNA表面結合更多的陽離子形成了離子對，阻止了溶液中的陽離子結合DNA表面的負電荷，繼而抑制了DNA的電荷中和與凝聚過程。通過陰離子作用的DNA表面電荷的變化和DNA形貌圖的觀察，本研究可以為進一步研究陰離子對DNA凝聚過程的影響提供一些理論指導，同時，陰離子對DNA的抑制凝聚作用在基因治療領域也成為了一個不可忽略的因素。