丹參植株鄰苯二甲酸與立枯絲核菌菌絲生長互作研究

馮靜，周冰謙，劉謙，王曉，盧恒，郭蘭萍，劉偉*，史國玉

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.齊魯工業大學(山東省科學院)山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；3. 中國中醫科學院中藥資源中心，北京100700；4.山東醫學高等專科學校，山東 濟南 250002)

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，首載于《神農本草經》，被列為上品[1]，具有活血祛瘀，通經止痛，清心除煩，涼血消癰的功效[2]。丹參為多年生草本植物，野生資源無法滿足市場的需求，主要來源為人工栽培。目前丹參栽培一年即采收，而連年的復種導致丹參土壤環境發生改變，植物無法適應環境的改變而產生致害作用，從而導致產量和品質連年下降，連作障礙成為丹參栽培過程中最為突出的問題，危及丹參臨床用藥的安全性、有效性、穩定性和可控性[3-5]。

連作障礙的形成是植物-土壤系統中多種因素綜合作用的結果，主要包括土壤環境及其理化性質的改變、土壤微生物種群的改變以及化感自毒作用[6-9]。研究表明，酚酸類化感自毒物質是引起連作障礙的重要因素之一[10-11]，而植物根系分泌的酚酸類自毒物質能夠顯著影響土壤微生物的生物量、多樣性和群落結構[12]。丹參連作不僅使土壤酸化，并且對其根際土壤細菌群落結構及多樣性影響較大，造成土壤中優勢菌群如水恒桿菌屬及伯克霍爾德氏菌的比例下降以及變形菌門、纖維弧菌屬豐度降低[13]。丹參連作一年，土壤中赤霉菌屬、馬鞍菌屬和梨孢菌屬豐度顯著增加，酵母菌屬豐度降低；連作兩年，土壤中鐮刀霉菌、赤霉菌屬、毛殼菌屬和馬鞍菌屬的豐度顯著增加，并且新增了Knufia、Clydaea與立枯絲核菌[3,14]。須根處理后的丹參土壤酸性組分較空白組增加了19.30倍，且新增了鄰苯二甲酸等化感物質[3]。百合、花生、含喜樹堿植物、野菊的根系分泌物中含有鄰苯二甲酸酯類物質，且鄰苯二甲酸對花生的發芽和根系生長具有抑制作用[15-18]。然而，有關丹參植株分泌的酚酸類自毒物質與病原菌生長之間的相互作用研究尚未見報道。

本研究選取鄰苯二甲酸與立枯絲核菌為實驗材料，研究丹參連作障礙產生的酚酸類自毒物質與病原菌之間的相互作用，以期揭示二者與丹參連作障礙的內在聯系，為研究丹參連作障礙提供新的思路和方法。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

丹參采自萊蕪紫光生態園有限公司，經山東中醫藥大學李佳教授鑒定為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.；立枯絲核菌購于廣東省微生物菌種保藏中心；鄰苯二甲酸，分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基、馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養基，均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器

BAS124S分析天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)；Agilent 7890A氣相色譜儀(安捷倫有限公司)；Agilent-1120高效液相色譜儀(安捷倫有限公司)；SW-CJ-2FD單面垂直凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；LDZM立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)；超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TGL-16醫用離心機(長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司)；XW-80A渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

2 方法

2.1 丹參植株內鄰苯二甲酸酯類化合物提取與分離

2.1.1 樣品溶液的制備

將丹參地上部與地下部分別粉碎，過篩，精密稱取樣品粉末0.5 g置于具塞錐形瓶中，加入甲醇10 mL，超聲提取30 min，取上清液過0.22 μm濾膜，備用。

2.1.2 標準品溶液的制備

精密稱取鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸雙-2-2乙氧基乙酯、鄰苯二甲酸二環己酯與鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯6種標準品0.01 g置于10 mL容量瓶中，加入甲醇充分溶解，并定容至10 mL，混勻，備用。

取上述6種標準品溶液各1 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至10 mL，過0.22 μm濾膜備用。

2.1.3 GC分析條件

氣相色譜柱：HP-5(30 m×250 μm，0.5 μm)；流速1 mL/min，進樣方式為不分流進樣；進樣口溫度：250 ℃；柱溫：程序升溫，60 ℃(保持2 min)，以5 ℃/min升至180 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至300 ℃，保持10 min；接口溫度：280 ℃；進樣量1.0 μL。

2.2 鄰苯二甲酸濃度實驗

稱取PDA培養基置于錐形瓶中，加入蒸餾水，混勻，封口，115 ℃高壓滅菌20 min備用。配制0.1 g/mL的鄰苯二甲酸母液備用。分別在未凝固的PDA培養基中精密加入相應濃度的鄰苯二甲酸乙醇溶液，不同濃度鄰苯二甲酸處理分為CK(空白對照)，A，B，C，D共5組(表1)。取一定量立枯絲核菌菌絲加入無菌水中重懸，備用。精密移取100 μL菌液于培養皿中涂板，涂布均勻后倒置，于25 ℃連續培養6 d，每隔24 h觀察其生長狀況，6 d后不同處理組中立枯絲核菌在PDA培養基上的生長狀況如圖1所示，對PDA培養基上的立枯絲核菌的菌落數和菌落最大直徑進行計算和測量。

表1 不同濃度鄰苯二甲酸處理Table 1 Groups with different concentrations of phthalic acid

圖1 培養6 d后不同處理組中立枯絲核菌在PDA培養基上的生長狀況Fig.1 The growth status of Rhizoctonia solani under different treatment groups of phthalic acid on PDA medium after 6 days

稱取PDB培養基置于燒杯中，加入蒸餾水，混勻，分裝至錐形瓶中，封口，121 ℃高壓滅菌20 min備用。配制0.1 g/mL的鄰苯二甲酸母液備用。取一定量立枯絲核菌菌絲加入無菌水中重懸，備用。按照表1不同處理組別處理，將其中PDA培養基替換成PDB培養基，25 ℃下在搖床中(120 r/min)恒溫黑暗培養立枯絲核菌6 d，每隔24 h觀察其生長狀況。

2.3 立枯絲核菌代謝物提取與分析

2.3.1 立枯絲核菌代謝物提取

培養6 d后，取1 mL PDB培養基置于EP管中，加入400 μL色譜純甲醇沉淀蛋白，加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋震蕩，冰浴靜置5 min，放入離心機，15 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，進樣HPLC進行分析。

2.3.2 HPLC檢測條件

色譜柱：Water-Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；進樣量：40 μL；檢測波長：274 nm；流速：1.0 mL/min；流動相：A相為0.3%甲酸水溶液，B相為甲醇，程序梯度洗脫，見表2。

表2 高效液相色譜儀程序梯度洗脫Table 2 Gradient elution by HPLC

2.3.3 對照品溶液的制備

精密稱取鄰苯二甲酸對照品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液使溶解，并定容至刻度線，搖勻，配制成濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液，4 ℃保存備用。

2.3.4 標準曲線的繪制

將鄰苯二甲酸對照品溶液按照2.3.2項下的HPLC檢測條件進行檢測，以鄰苯二甲酸峰面積(Y)為縱坐標，質量(X)為橫坐標對鄰苯二甲酸進行線性回歸擬合，得到回歸方程為Y=454 858X-107.14，r2=0.998 1，鄰苯二甲酸在0.001～0.015 mg范圍內具有良好的線性。

2.3.5 樣品中鄰苯二甲酸含量測定

將供試品溶液按照2.3.2項下的HPLC檢測條件進行檢測，以峰面積代入回歸方程中計算鄰苯二甲酸的含量(表3)。

表3 供試品溶液中鄰苯二甲酸含量(n=3)Table 3 Phthalic acid content in sample solution(n=3) 單位：mg/mL

3 結果

3.1 丹參樣品中鄰苯二甲酸酯類成分分析

將丹參樣品色譜圖與標準品色譜圖進行保留時間的比較，丹參地上部樣品中含有鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸雙-2-2乙氧基乙酯、鄰苯二甲酸二環己酯與鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯6種鄰苯二甲酸酯類成分(圖2)，總相對含量為8.264%；丹參地下部樣品中含有鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸雙-2-2乙氧基乙酯、鄰苯二甲酸二環己酯與鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯5種鄰苯二甲酸酯類成分(圖3)，總相對含量為1.069%。

時間/min1—鄰苯二甲酸二甲酯；2—鄰苯二甲酸二異丁酯；3—鄰苯二甲酸二丁酯；4—鄰苯二甲酸雙-2-2乙氧基乙酯；5—鄰苯二甲酸二環己酯；6—鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯。圖2 丹參地上部中鄰苯二甲酸酯類化學成分Fig. 2 PAEs in the aboveground portion of Salvia miltiorrhiza Bge.

時間/min1—鄰苯二甲酸二異丁酯；2—鄰苯二甲酸二丁酯；3—鄰苯二甲酸雙-2-2乙氧基乙酯；4—鄰苯二甲酸二環己酯；5—鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯。圖3 丹參地下部中鄰苯二甲酸酯類化學成分Fig. 3 PAEs in the underground portion of Salvia miltiorrhiza Bge.

3.2 PDA培養基培養立枯絲核菌

培養6 d后，CK組與A組作為對照組，未加入立枯絲核菌菌液，在相同條件下培養相同時間后對照組未有菌體生成；C組較B組菌落數增加了25.33%，較D組菌落數增加了54.26%，B組較D組菌落數增加了23.08%；當PDA培養基中鄰苯二甲酸濃度為適宜濃度(C組)時，立枯絲核菌菌落數最多，當PDA培養基中鄰苯二甲酸濃度為高濃度(D組)時，立枯絲核菌菌落數最少(圖4)。

圖4 不同處理組PDA培養基上立枯絲核菌菌落數統計Fig.4 Colony count of Rhizoctonia solani in PDA medium of different treatment groups

培養6 d后，加入不同濃度鄰苯二甲酸的PDA培養基中立枯絲核菌菌落最大直徑存在顯著性差異(P<0.05)，見圖5。其中CK組與A組作為對照組，未加入立枯絲核菌菌液，在相同條件下培養相同時間后對照組未有菌體生成；當PDA培養基中鄰苯二甲酸濃度為適宜濃度(C組)時立枯絲核菌菌落最大直徑平均值最大，為5.21 mm；當PDA培養基中鄰苯二甲酸濃度為高濃度(D組)時立枯絲核菌菌落最大直徑平均值最小，為1.84 mm；當PDA培養基中未加入鄰苯二甲酸(B組)時菌落最大直徑平均值為4.07 mm。

圖5 不同處理組PDA培養基上立枯絲核菌菌落最大直徑均值Fig.5 The average of maximum diameter of the colony count of Rhizoctonia solani in PDA medium of different treatment groups

3.3 PDB培養基培養立枯絲核菌

培養6 d后，立枯絲核菌生長狀況見圖6。其中CK組與A組作為對照組，未加入立枯絲核菌菌液，在相同條件下培養相同時間后對照組未有菌體生成。當PDB培養基中鄰苯二甲酸濃度為適宜濃度(C組)時立枯絲核菌菌落最多，其質量為17.78 g；PDB培養基中未加入鄰苯二甲酸(B組)時，菌落數次之，其質量為14.45 g；當PDB培養基中鄰苯二甲酸濃度為高濃度(D組)時立枯絲核菌菌落最少，其質量為5.41 g(圖7)。

圖6 培養6 d后不同處理組中立枯絲核菌在PDB培養基上的生長狀況Fig. 6 The growth status of Rhizoctonia solani in different treatment groups of phthalic acid in PDB medium after 6 days

圖7 培養6 d后不同處理組中立枯絲核菌質量Fig.7 The weight of Rhizoctonia solani in different treatment groups of phthalic acid in PDB medium after 6 days

3.4 PDB培養基中立枯絲核菌代謝物分析

不同處理組別PDB培養基中立枯絲核菌代謝物分離色譜圖見圖8。將樣品色譜圖與鄰苯二甲酸標準品色譜圖進行保留時間的比較，A組、C組、D組中均檢測出鄰苯二甲酸，但通過含量測定發現，與初始加入量相比，3組鄰苯二甲酸含量幾乎無變化。

時間/min1—對照品；2—PDB培養基供試品。圖8 對照品、PDB培養基供試品的HPLCFig. 8 HPLC of reference and PDB medium sample

4 討論

丹參作為常用大宗藥材之一，每年的需求量高達2萬噸[3]，野生資源無法滿足市場的需求量，因此丹參藥材的主要來源為人工栽培，而連年的復種造成丹參土壤環境發生改變，丹參產量和品質下降[19-20]，連作障礙成為丹參生產過程中亟待解決的問題。

連作丹參土壤中鄰苯二甲酸含量相對較高[3]，立枯絲核菌豐度增加[13]。立枯絲核菌是造成水稻紋枯病、馬鈴薯莖基腐病的主要病原菌，也是造成植物立枯病的主要真菌[21]。立枯病作為一種土傳病害，是造成連作障礙的重要原因之一[22]。

目前對于丹參連作障礙的研究僅限于土壤病原菌或酚酸類自毒物質[13-14]，對于二者之間的研究并未有報道。本研究中將導致丹參連作障礙發生的酚酸類自毒物質鄰苯二甲酸與病原真菌立枯絲核菌進行互作研究，通過室內菌絲生長抑制實驗發現，鄰苯二甲酸對立枯絲核菌的生長具有濃度效應，這與田給林[23]研究的酚酸對草莓尖孢鐮刀菌菌絲生長效應結果一致。在相同培養條件下，鄰苯二甲酸的加入促進了立枯絲核菌的生長繁殖，但其含量在菌絲生長前后無變化。由此推測鄰苯二甲酸會起到類似于催化劑的作用，使立枯絲核菌快速生長并致害丹參，與大田中丹參連作障礙在8月份爆發的現象相符合。通過對鄰苯二甲酸與立枯絲核菌菌絲生長互作研究，旨在從酚酸類化感自毒物質與病原菌方面揭示丹參連作障礙產生的原因，為解決丹參連作障礙提供理論依據。