基于網絡藥理學探討葶藶大棗瀉肺湯治療新冠肺炎的作用機制

劉京華，譚旺曉，王斯維，王雨，王小瑩

(天津中醫藥大學，天津 301617)

2019年暴發的新冠肺炎(COVID-19)，具有顯著的傳染性，目前已成為全球性問題[1-2]。在COVID-19治療早期以中醫藥干預為主，通過中西醫結合的治療方針，能夠充分發揮中醫藥在疫情防治中的作用[3]。

中醫理論辯證COVID-19的發病機制為濕邪致病，初期表型為寒濕，中期以濕阻肺脾證和濕熱蘊肺證最為常見，后期多表現為氣陰兩虛證和肺脾氣虛證[4]。由COVID-19診療方案的中醫分期病機特點可知，在使用頻次超過兩次的17味中藥中，葶藶子居于止咳平喘藥的首位[5]，發揮藥效的主要成分為葶藶子中的芥子苷與β-谷甾醇。研究報道，β-谷甾醇具有舒張支氣管平滑肌及祛痰作用[6]。現代藥理學研究表明，葶藶子具有較強的利尿作用，與杏仁、大黃配伍可用于治療胸脅積水[7]；還具有廣譜抗菌作用[8]，可通過抗炎與抗氧化作用來保護心肌細胞免受損傷，從而起到保護心臟作用[9]。COVID-19疫情發生以來，復方藥在抗疫方面起到重要的作用，曹新福等[10]報道葶藶子與石膏配伍在防治COVID-19用藥中的置信度最高，而葶藶大棗瀉肺湯是由葶藶子和大棗組成的中藥復方。北宋《開寶本草》述該藥“療肺壅上氣咳嗽，止喘促，除胸中痰飲”[8]。清代名醫張璐在《千金方衍義》中指出“葶藶破水瀉肺，大棗護脾通津，乃瀉肺而不傷脾之法，保全母氣以為向后復長肺葉之根本”[11]。葶藶子具有入肺瀉氣和開結利水之功效，可使肺氣通利，痰水下引，進而喘可平，腫可退[12]。大棗的作用主要是保護肺氣，防止藥物對患者肺氣有損傷，提高治療的安全性[13]。葶藶大棗瀉肺湯臨床上主要用于病毒性肺炎、肺心病、結核性胸腔積液的治療，且應用效果已經得到了多方認證[14-15]。

中藥具有多成分、多靶點、系統調節的作用特點，但由于其成分復雜，作用靶點眾多，很難完全闡明其作用機制。網絡藥理學的整體性、系統性與中醫藥的整體觀、辨證論等基本理論趨于一致[16]，在藥物靶點鑒定、有效成分發現、作用機理研究、臨床前研究等領域具有廣泛的應用價值[17]，其主要通過對復雜的疾病網絡進行協同調節，以交互式的網絡調控方式來研究整體的病理進展。基于中藥成分數據庫及其與靶點、疾病之間的相關信息構建藥材-成分-靶點-疾病網絡模型[18]，能夠揭示其內在聯系，對中藥提高靶標療效具有指導意義。

本研究基于網絡藥理學探討葶藶大棗瀉肺湯治療COVID-19的潛在作用靶點與信號通路，主要運用中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)、The Human Gene Database(GeneCards)等數據庫收集葶藶大棗瀉肺湯治療 COVID-19 的相關靶點，并運用相關數據庫進行靶點功能、通路的預測，為進一步研究葶藶大棗瀉肺湯潛在治療 COVID-19 的藥理作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 葶藶大棗瀉肺湯主要活性化合物的篩選

口服生物利用度(OB)表示有效成分或活性基被吸收到達體循環并被吸收的速度與程度，OB 值越高通常表示藥物的生物活性分子的類藥性(DL)越好。本研究以葶藶子、大棗兩味中藥為關鍵詞，以OB≥30%、DL≥0.18 為篩選參數，利用TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索中藥的主要活性化合物。

1.2 葶藶大棗瀉肺湯主要作用靶點和相關疾病靶點的收集

通過TCMSP搜索方中主要活性化合物的相關靶點，運用GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫檢索與COVID-19相關的基因。通過分析，得到葶藶大棗瀉肺湯與COVID-19的共同靶點蛋白。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡、化合物-靶點-疾病網絡的構建

將葶藶大棗瀉肺湯的主要活性化合物、靶點通過STRING數據庫(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，https://string-db.org/)和 Cytoscape3.6.1 軟件(http://www.cytoscape.org/)構建靶標PPI網絡、藥物-化合物-靶點網絡。

1.4 靶點通路分析

將上述篩選得到的藥物與疾病相關的靶點輸入Metascape數據庫(http://metascape.org/gp/index.html/main/step1)，通過輸入靶基因名稱列表并選定物種為“homo sapiens”，進一步點擊Custom analysis設置參數分析，選擇GO與KEGG富集分析。

1.5 分子對接

為進一步分析葶藶大棗瀉肺湯對于COVID-19 的干預作用，我們將藥物靶點中化合物度值較高的前十種與ACE2進行分子對接。對接方法如下：

(1)小分子和蛋白的處理：使用Sybyl 2.0軟件構建中藥單體小分子化合物，并對化合物的結構進行能量優化，存為mol2文件。從PDB(protein data bank)數據庫中下載ACE2的蛋白晶體結構，蛋白ID為1R4L，利用Sybyl 2.0軟件提取出蛋白中的配體，將無配體蛋白和配體分別保存為PDB文件。

(2)分子對接：通過混合Lamarckian遺傳算法(LGA)進行對接。在Autodock 4.2軟件中打開無配體蛋白文件，并為其加入電荷。通過配體文件的位置確定蛋白晶體的結合域，在結合域處設定結合晶格，晶格的xyz軸均為40格點。將小分子mol2文件加入電荷成為pdbqt文件，使用該文件在結合晶格處與蛋白進行虛擬對接。算法設定為遺傳算法(genetic algorithm，GA)，四元數(quaternion)與小分子旋轉鍵扭轉次數(torsion)都為30次，運行次數為30輪次，其他設定均為默認值。

(3)對接結果分析：將對接結果按照結合能絕對值進行排序，選取結合能絕對值最高的構象，使用Pymol軟件對結合位點進行可視化分析。

2 結果

2.1 葶藶大棗瀉肺湯主要活性化合物

通過TCMSP檢索，設置參數OB≥30%、DL≥0.18共篩選出主要活性化合物27個，其中大棗15個，葶藶子12個。按照OB值大小排列，表1為葶藶大棗瀉肺湯的活性成分。

表1 葶藶大棗瀉肺湯活性化合物基本信息Table 1 Basic information on active compounds of Tingli Dazao Xiefei decoction

續表1

2.2 藥物-化合物-靶點網絡

將表1中27個主要活性化合物通過TCMSP數據庫預測主要活性成分調控靶點，去除重復值，共得到224個靶點。運用Cytoscape軟件構建藥物-化合物-靶點網絡(圖1)，該網絡總共有19個節點和452條邊。其中葶藶子所調控的相關靶點主要與細胞凋亡、炎癥與氧化應激相關，而大棗所調控的靶點主要參與炎癥反應，二者聯用在突出調控炎癥反應的同時，也具有調控氧化應激及細胞凋亡等方面的作用。分析結果表明，葶藶子與大棗共同調控的靶點有45個(圖2)，其中排名靠前的靶點主要有：前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、鈉通道蛋白5亞單位α(SCN5A)、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位α(PRKACA)、γ-氨基丁酸受體亞單位α-1(GABRA1)，主要參與調控機體的炎癥反應。因此兩藥共同作用時，能夠在抗炎方面發揮協同增效的作用。

圖1 藥物-化合物-靶點網絡調控圖Fig.1 The regulation diagram of compound-target-pathway network

圖2 葶藶-大棗共同調控靶點網絡圖Fig.2 The targets′ network diagram coregulated by Tingli and Dazao

通過拓撲分析參數表(表2)來觀察藥物的主要活性成分調控的作用程度。由化合物所對應靶點的邊數得知，排名前十的藥物成分主要有槲皮素、山奈酚、小檗堿、異鼠李素、β-谷甾醇等，這些成分可能是葶藶大棗瀉肺湯的主要活性成分。

表2 藥物-化合物-靶點網絡拓撲分析參數表Table 2 Compound-target-pathway network topology analysis parameters

2.3 預測葶藶大棗瀉肺湯治療COVID-19的靶點

根據GeneCards數據庫檢索COVID-19的靶點，得到251個相關靶點。運用Venn平臺將葶藶大棗瀉肺湯的靶點與 COVID-19 的治療靶點取交集，得到39個共同靶點，見圖3。

圖3 葶藶大棗瀉肺湯治療新型冠狀病毒肺炎靶點Venn圖Fig.3 Venn diagram of the targets of COVID-19 treated with Tingli Dazao Xiefei decoction

2.4 葶藶大棗瀉肺湯與COVID-19 PPI網絡的構建

圖3得到的39個靶點在STRING平臺進行PPI網絡分析，核心網絡圖(圖 4)包含39個節點，394條邊，其中節點表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關系，線條越多表示關聯度越大。靶蛋白平均節點度值為20.2，超過平均度值的靶蛋白有20個，說明這20個靶蛋白是PPI網絡中的關鍵靶點，提示葶藶大棗瀉肺湯可能通過調節這些靶點發揮治療COVID-19的作用。20個關鍵靶點依據度值由高到低排序，其與炎癥疾病相關的主要靶點有:腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、C-C基序趨化因子2(CCL2)等。結果見表 3。

圖4 葶藶大棗瀉肺湯與COVID-19 PPI網絡圖Fig.4 Protein-protein interaction network diagram of Tingli Dazao decoction and COVID-19

表3 葶藶大棗瀉肺湯 PPI 網絡中大于平均度值的靶標蛋白Table 3 Target proteins with above-average values in PPI network of Tingli Dazao Xiefei decoction

2.5 葶藶大棗瀉肺湯靶點通路分析

將39個靶點上傳到Metascape數據庫中，進行GO富集分析和KEGG通路注釋，共得到分子功能、生物過程和細胞成分GO條目232個，KEGG富集通路146條。根據P值分別得到排名前20富集柱狀圖(如圖5(a)、6(a)所示)。同時，根據相關度進行群集ID著色，如圖5(b)和6(b)，顏色區分不同類別，且節點面積與聚集程度成正相關。將所有靶點進行全連接網絡交互，得到圖5(c)、6(c)，不同顏色表示互作網絡中可識別到的子模塊，且節點面積與富集分析的頻次成正比。

通過分析發現，GO功能富集主要涉及凋亡信號途徑、外部刺激反應的正向調節、對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、細胞因子介導等。根據網絡交互顯著性分析，得到子模塊如圖5(d)所示，細胞腫瘤抗原p53(TP53)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、MAPK8等為關鍵作用靶點，在GO富集中起到重要作用。

圖5 葶藶大棗瀉肺湯靶點的 GO 富集分析及相關網絡圖 Fig.5 GO enrichment analysis and network diagram of targets regulated by Tingli Dazao Xiefei decoction

KEGG通路注釋主要參與調控IL-17、NF-κB、甲型流感、肺結核等信號通路，其中在 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，Chagas disease (American trypanosomiasis)，Leishmaniasis，Hepatitis B，Toxoplasmosis五條通路上靶點富集較多。根據網絡交互顯著性分析，得到子模塊如圖6(d)所示，TP53，MAPK1，MAPK14等為關鍵作用靶點，在治療新型冠狀病毒肺炎中起到藥效作用。

圖6 葶藶大棗瀉肺湯治療 COVID-19 的 KEGG 富集分析及相關網絡圖Fig.6 KEGG pathway analysis and network diagram of Tingli Dazao Xiefei decoction for the treatment of COVID-19

2.6 葶藶大棗瀉肺湯活性成分以及臨床用藥與ACE2對接結果分析

Lopes等[19]報道血管緊張素轉換酶-2(ACE2)是一種促進冠狀病毒進入細胞的蛋白質。Willcox等[20]報道 COVID-19與ACE2結合，促進人體感染。張勇剛等[21]對結腸上皮細胞單細胞進行測序分析，結果表明共有5556個基因能夠被ACE2表達。本研究對ACE2的表達基因進行分析，發現其中有60個基因能夠受到葶藶大棗瀉肺湯的調控，提示葶藶大棗瀉肺湯可能通過作用于ACE2，進而對相關基因進行調控。因此在本研究中，對葶藶大棗瀉肺湯中藥主要有效成分進行分析，并按照拓撲分析將度值排名前十的成分采用分子對接的方法與ACE2受體的結合能進行預測，發現其均與ACE2具有較好的結合效果。我們對靶點度值前4的成分進行Pymol可視化分析，其中槲皮素、山奈酚、異鼠李素與ACE2具有共同的結合位點GLU-406；β-谷甾醇的結合位點為ARG-514；槲皮素的結合位點GLU-375也已被證明為ACE2的活性位點。因此推測葶藶大棗瀉肺湯可通過以上位點與ACE2進行結合，從而抑制病毒與ACE2間的相互作用，為葶藶大棗瀉肺湯的后續研究提供理論基礎。主要藥物成分與ACE2受體的結合能見表4，用PyMOL軟件顯示的藥物主要活性成分與ACE2(PDB為1R4L)的分子對接3D圖譜見圖7。

表4 主要藥物成分與ACE2受體的結合能表Table 4 Binding energy analysis of main components with ACE2 receptor

圖7 藥物主要活性成分與ACE2的分子對接3D圖譜Fig.7 3D image of main active components binded with ACE2 receptor

3 討論

COVID-19屬于中醫理論的“溫病”范疇，其表現為外感溫邪，以發熱為主癥，易化燥傷陰，易內陷生變，具備溫邪致病的特性[22]。病機表現為“濕、熱、毒、瘀、虛”[23]，由瘟疫論解析可知，其發病突然，具有一定的傳染性及特異性[24]。在防疫期間COVID-19診療方案里含有葶藶子的處方藥所對應的癥狀分別有：寒濕郁肺癥、濕毒郁肺癥、疫毒閉肺癥、氣營兩燔癥。而葶藶大棗瀉肺湯中君藥為葶藶子，因此探究其對于COVID-19的潛在防疫作用，可以為當前的抗疫工作提供一定的基礎支持。

葶藶大棗瀉肺湯組方由葶藶子和大棗組成，葶藶子味苦、辛，具有破堅逐邪、通利水道的作用，治療咳嗽氣喘。為防葶藶子性猛峻瀉而傷正氣，故佐以大棗，安中以緩和藥性[25]。現階段藥理研究中，葶藶子具有止咳平喘、抗菌、抗炎、調血脂等藥理作用[7]，大棗具有抗氧化、提高免疫、保護肝臟等作用[26]，葶藶大棗瀉肺湯治療肺炎的主要療效成分與靶點尚不明確。本文利用網絡藥理學的方法，以中藥有效成分和藥物靶標為研究對象，預測藥物所對應的靶點與通路，探討葶藶大棗瀉肺湯對于COVID-19的潛在靶標療效意義。

本研究篩選得到葶藶大棗瀉肺湯的主要活性成分 27 個，通過藥物靶點分析得到，槲皮素、山奈酚、小檗堿、異鼠李素等化合物對應靶點的關聯度較高。槲皮素具有抗病毒、減輕肺臟炎癥、抗氧化等作用，可通過抑制JAK2/STAT3信號通路激活而改善氣體交換功能，抑制炎性介質的釋放，從而減輕LPS誘導的急性肺損傷[27]。山奈酚具有抗炎、抗菌、免疫調節、疾病預防等作用[28]，可明顯改善小鼠肺組織X線照射后的炎性滲出，對放射性肺損傷具有一定的防治作用，并可降低炎性因子TNF-α，IL-6的釋放，抑制NF-κB和MAPK通路的激活，進一步阻止炎性因子的生成，最終通過抗炎、抗氧化作用減少組織損傷[29]。大棗中的成分小檗堿可抑制細胞 TLR4/MyD88 依賴型信號通路，進一步抑制 NF-κB 激活，顯著減少 NLRP3 炎癥小體的表達，從而達到一定的抑制炎癥反應作用[30]。綜上所述，預測葶藶大棗瀉肺湯可由其主要活性成分調節肺部疾病，并進一步調控炎癥反應，達到協同增效的作用，預測其可通過抑制炎癥反應對COVID-19達到一定的輔助治療效果。

通過網絡藥理學分析發現，有45個靶點受到葶藶子與大棗的共同調控，主要涉及對NF-κB，p38/MAPK及JAK2/STAT3等信號通路的抑制，提示葶藶子與大棗配伍使用能夠通過以上靶點發揮對炎癥反應的抑制作用。大棗中的主要成分小檗堿還能夠抑制炎癥小體NLRP3的表達，與葶藶子配伍后，能夠從不同角度發揮抗炎作用，增強藥物的抗炎效果，發揮協同增效的作用。盡管已有研究證實葶藶子具有一定的抗炎作用，但其主要通過利水功效減輕肺部損傷[31]。由于葶藶子的藥效過猛，對機體的正氣具有一定的損傷，大棗藥性溫和，可緩和葶藶子的藥性，保護心脾[32-33]，二者配伍使用，在改善機體功能的同時[34]，還能增強抗炎的效果，從而對炎癥風暴的產生具有一定的抑制作用，對COVID-19發揮防治功效。

同時對得到的活性成分進行靶點預測，發現葶藶大棗瀉肺湯中發揮主要作用的靶點有39個，經PPI網絡分析發現葶藶大棗瀉肺湯干預COVID-19發揮主要作用的靶點為TNF，CASP3，MAPK8，MAPK1，CCL2等。TNF可通過提高白細胞的吞噬能力、氧化爆發和釋放蛋白酶來加強其對入侵微生物的殺傷作用，在SARS-CoV感染者急性期血清中 TNF水平與對照組比較顯著增高，感染控制后TNF有所下降，說明TNF與肺部感染的發病有關[35]。MAPK1和MAPK8是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員，MAPK通路在控制炎癥反應和免疫反應的誘導和調節中具有重要作用[36]，據報道MAPK信號通路是病毒RNA合成中高效輸出病毒NP所必需的，抑制該通路則可減少流感病毒的復制和炎癥癥狀[37]。此外當病原體攻擊機體時MAPKs與炎癥細胞因子和趨化因子的表達密切相關，其中趨化因子 CCL2能夠特異性地趨化嗜酸性粒細胞聚集到氣道黏膜表面，引起支氣管上皮組織的損傷[38]。綜上所述，葶藶大棗瀉肺湯中關鍵成分可能通過調控TNF，MAPK，CCL2等靶點而發揮抗炎作用，保護肺損傷，從而輔助治療COVID-19。

研究報道COVID-19病理檢查發現肺組織有水腫、蛋白樣滲出物、局灶性反應性肺細胞增生伴斑片狀炎性細胞浸潤[39]。由此說明當組織受到損傷或者感染，炎癥反應是機體抵抗病原體的常見方式之一，有助于加強機體對病毒的清除作用[40]。促炎和抗炎機制的平衡對于維持機體免疫穩態至關重要[41]，若機體從“自我保護”演變為“過度保護”的狀態，打破炎癥反應的平衡狀態，使免疫細胞產生正反饋反應進而誘導大量的促炎因子TNF-α，IL-1β，IL-8等的生成，可觸發機體導致過度炎癥反應即細胞因子風暴，短時間內大量產生炎癥因子并對組織、器官造成嚴重病理損傷[42]。因此探索葶藶大棗瀉肺湯對炎癥相關通路的調節作用，及防止細胞因子風暴的產生具有重要意義。

本研究進一步對有效靶點分別進行GO與KEGG富集分析，得到GO條目232個，KEGG通路146條，GO富集分析結果顯示靶點主要富集在凋亡信號途徑、外部刺激反應的正向調節、脂多糖應答等。KEGG通路結果顯示，葶藶大棗瀉肺湯主要涉及IL-17信號通路、NF-κB 信號通路、肺結核等。IL-17信號通路在自身免疫和感染中誘導病理變化，可通過MAPK與NF-κB等途徑誘導炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF的產生并協同加重炎癥損傷[43]，在中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的血清中檢測出IL-17，IL-6含量明顯增高[44]，其中IL-6是誘發炎癥風暴的重要通路，當機體的炎癥平衡狀態被打破，免疫系統在殺死病毒的同時，也會殺死大量肺的正常細胞，嚴重破壞肺的換氣功能，從而產生“白肺”[45]。表明細胞因子風暴與疾病嚴重程度相關，另外IL-17通路的激活對膿毒癥引起的肺部炎癥起關鍵作用[46]。NF-κB作為一種涉及炎癥介質產生、細胞增殖、細胞外基質交聯和細胞凋亡轉錄因子，參與了多種炎癥反應的信號轉導過程[47]。研究報道重癥支氣管肺炎組的NF-κB表達水平均顯著高于空白對照組，同時，其上游PI3K/AKT的磷酸化刺激NF-κB的活性增強，產生二聚體入核，從而調控炎癥因子的合成和釋放，導致血漿中的趨化因子和細胞因子處于動態變化水平，與肺組織病理損傷息息相關[48]。綜合上述研究結果，預測葶藶大棗瀉肺湯具有抑制促炎因子的表達，減輕肺部炎性損傷的潛在機制，還可通過調節炎癥相關信號通路來抑制細胞因子風暴的爆發，可為進一步防治COVID-19提供一定的基礎支持。

ACE2受體是一種可溶性的重組蛋白，藥物成分與之結合后，可以抑制病毒與其活性部位相結合，從而防止病毒的傳播[49]。分子對接結果顯示，葶藶大棗瀉肺湯中的主要活性成分與ACE2受體的結合能均遠小于-25.10 kJ/mol，提示以上成分均與ACE2具有較好的結合效果。由此可見，藥物活性成分與該受體結合較為穩定，推測葶藶大棗瀉肺湯可通過與ACE2受體結合，從而抑制病毒與ACE2間的相互作用，進而存在潛在地治療COVID-19的作用。排名前十的成分中6種來源于葶藶子，分別為：β-谷甾醇、蛇床子素、豆甾醇、槲皮素、山奈酚與異鼠李素；另外4種來源于大棗，分別為：(S)-椰油堿、斯特法林、香豆素、小檗堿。表明葶藶子與大棗中的成分均與ACE2具有一定的結合能力，可共同作用于機體，進而發揮治療COVID-19的作用。

綜上所述，本文通過網絡藥理學的方法，預測葶藶大棗瀉肺湯對于COVID-19潛在的治療靶點及調控通路，得到葶藶大棗瀉肺湯具有潛在抑制機體產生炎癥風暴的作用。本研究為葶藶大棗瀉肺湯治療COVID-19的藥效機制研究提供了初步的預測，其確切的機制仍需后續的實驗研究驗證。