血管內皮生長因子過表達骨髓間充質干細胞對支氣管肺發育不良的保護作用

藍國鋒 王藝瑾 黎云芳 韋清華 石豐浪 崔其亮 Hussnain Mirza 史學凱

1廣西南寧市第二人民醫院新生兒科（南寧530031）；2廣州醫科大學附屬第三醫院兒科（廣州510150）；3美國佛羅里達兒童醫院兒科（USA）

支氣管肺發育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早產兒（尤其是小早產兒）常見的慢性呼吸系統疾病。胎齡＜32 周的早產兒中，BPD 發生率為12%～32%［1］，超低出生體重兒（出生體質量＜1 000 g）與極早早產兒（胎齡＜28 周）BPD 發生率高達50%［2］，但是BPD 在臨床上缺乏有效的治療手段［3］，嚴重影響BPD 患兒的預后及生存質量。

BPD 臨床上常表現為肺泡發育不良、肺泡數量減少、肺泡簡單化和微血管發育異常等癥狀［4］。流行病學研究［5］顯示，BPD 的發生過程復雜，是多種因素共同作用的結果。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為血管發生方面的核心因子［6］，其表達水平影響著肺血管發育，進而影響BPD 的發生發展［7］。VEGF 主要由肺泡上皮細胞產生，對內皮細胞的遷徙、生存、增殖和分化起著關鍵作用，是整個胚胎期、胎兒期和出生后肺血管生長與維持最關鍵的調節因子［8］，其缺少可影響胎兒肺微血管系統的形成，導致微血管床密度減低、肺泡簡單化，使正常肺泡的發育受阻［9］，從而增加新生兒BPD 的發生率。VEGF 在維持肺部正常發育過程中起著關鍵的作用。已有研究［10-11］表明干細胞可以有效阻止BPD的發展進程。

為探索VEGF 改善BPD 的作用及其機制，本研究構建了過表達VEGF 基因的骨髓間充質干細胞（BMSC-VEGF）。在動物BPD 模型中，檢測其對于維持肺部血管形成和肺泡細胞正常生長的作用以及作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 高氧誘導小鼠BPD模型構建將9只新生FVB小鼠幼仔與2 只母鼠（購自北京維通利華）暴露于75%氧氣有機玻璃室或出生時的室內空氣中，并持續飼養14 d。通過氧濃度控制裝置（Biospherix，Lacona，N.Y.）調節通氣并保持室內75%氧濃度，同時除去CO2，使其含量不超過0.5%。通過空氣凈化器和活性炭過濾氨。每隔48 h 置換常氧母鼠和高氧母鼠，以防止母鼠氧氣中毒。

高氧組：FVB 小鼠幼仔從出生后第1 天（出生6 h 內）在75%氧氣條件下進行飼養，持續2 周；常氧組：FVB 小鼠幼仔從出生時，飼養在室內空氣中，持續2 周。在第14 天，當BPD 模型中慢性高氧肺損傷明顯時［12］，將小鼠置于室內空氣中，高氧組隨機分為3 組：高氧模型組、高氧模型+NC 組及高氧模型+VEGF 組。常氧組與高氧模型組置于室內空氣中飼養2 周；高氧模型+NC 組靜脈內/肌肉注射含有對照的BMSCs 細胞，高氧模型+VEGF 組靜脈內/肌肉注射含有VEGF 過表達載體的BMSCs 細胞，置于室內空氣中繼續飼養2 周。各組小鼠幼仔恢復兩周后，水合氯醛麻醉處死，收集肺組織用于如下所述的組織學和免疫組織化學研究。所有動物實驗均獲得廣西南寧市第二人民醫院倫理委員會動物護理和使用批準（2017-10-08）。

1.2 BMSCs 分離、培養、分化和免疫熒光鑒定從5～7 周大的FVB 小鼠的股骨和脛骨中原代分離BMSCs 細胞［10］。然后，將BMSCs 細胞離心、濃縮并鋪板。每2～3 天更換1 次BMSCs 條件培養基。傳2～3 代后，選取狀況良好的細胞進行后續實驗。

以上BMSCs 用胰酶消化，PBS 洗滌2 次，再通過免疫熒光檢測BMSCs 的表面標志蛋白CD44、CD106 的表達。其過程為：細胞爬片制作，抗原修復、封閉，一抗4 ℃孵育過夜，CD44 一抗（兔抗小鼠，abcam，貨號：ab157107）1∶1 000 稀釋；CD106 一抗（兔抗小鼠，CST，貨號：39036）1∶400 稀釋。熒光二抗室溫避光孵育30 min。DAPI 復染，洗滌，封片，鏡檢，最后分析。

1.3 VEGF 過表達BMSCs 構建通過合成VEGF序列（來自NCBI，XM_021581441），構建慢病毒載體，再通過病毒包裝與純化，滴度檢測，最后慢病毒感染BMSCs 細胞，得到VEGF 過表達慢病毒穩轉的BMSCs 細胞。RT-PCR 檢測BMSCs 細胞VEGF基因的表達，驗證過表達效率。

1.4 靜脈注射VEGF-BMSCs 和條件培養基第14天向高氧模型+VEGF組靜脈注射VEGF-BMSCs，常氧組與高氧模型注射等劑量的條件培養基，而高氧模型+NC 組注射等劑量的NC+BMSCs。

1.5 肺呼吸阻力檢測為了評估幼鼠肺呼吸阻力，使用超聲霧化器（Scireq，Montreal，Canada）將生理鹽水和吸入乙酰甲膽堿（1.6、5、10、16 和50 mg/mL）霧化。在基線時計算平均氣道阻力，吸入每次劑量的乙酰甲膽堿之后記錄最大值。

1.6 Masson Trichrome 染色通過Masson Trichrome染色肺泡組織。首先肺泡細胞脫水、包埋，制作石蠟切片。蘇木精核染15 min，麗春紅酸性染液染色10 min，磷鉬酸溶液處理5 min，再苯胺染液復染5 min，多次脫水，最終封片，分析各組肺泡組織纖維化及肺泡重構情況。

1.7 Western blot 實驗蛋白質免疫印跡方法檢測增殖相關蛋白Ki67 的表達。提取肺組織總蛋白，BCA 法標準曲線測定總蛋白含量，通過SDSPAGE 電泳，半干轉印蛋白，室溫封閉60 min，Ki67一抗［兔抗小鼠，CST（#12202）］1∶1 000 稀釋，4 ℃孵育過夜；羊抗兔二抗孵育，室溫孵育1.5 h，成像，圖片掃描后應用Image-ProPlus Version 6.0 圖像分析軟件對蛋白免疫印跡灰度值進行定量分析。目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值表示蛋白質相對表達水平。

1.8 統計學方法采用SPSS 17.0（SPPS，Inc.）對數據進行統計學分析，多組間數據進行比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組數據進行比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs 鑒定通過免疫熒光的方法檢測分離的BMSCs 表面標志物CD44 和CD106 的表達。在BMSCs中CD44和CD106的表達均為陽性（圖1），這與以往的研究結果一致［13］。提示分離的BMSCs滿足后續實驗要求。

圖1 免疫熒光法檢測分析CD44、CD106 表達Fig.1 The expression of CD44 and CD106 was detected by immunofluorescence

2.2 RT-PCR檢測BMSCs細胞VEGF基因表達通過RT-PCR 檢測BMSCs-VEGF 的VEGF 表達情況，以驗證VEGF 過表達效率。從圖2 可以發現，VEGF 過表達組其表達量是（80.85±6.71），對照組及空載組分別為（0.98±0.04）、（1.06±0.08），相差80 倍左右，差異有統計學意義（P＜0.01），提示慢病毒可以有效感染BMSCs 細胞并表達VEGF。

圖2 VEGF 在各組中基因表達量Fig.2 VEGF expression in each group

2.3 BMSCs-VEGF 可以改善BPD 幼鼠肺泡重構、肺纖維化相比健康對照幼鼠，暴露于高氧條件下2 周的幼鼠，恢復期間以單劑量給予BMSCs 條件培養基的高氧組，其肺泡整體結構發生嚴重改變：氣管嚴重變形、肺泡簡單化、氣道重塑、嚴重炎性細胞浸潤以及肺細胞膠原含量增高和嚴重肺纖維化。高氧2 周后，注射BMSCs-VEGF 恢復2 周的VEGF 組，相比高氧組幼鼠，其肺泡結構得到明顯的改善，肺纖維化程度顯著降低，膠原含量明顯減少，肺泡化豐富而有序，氣管結構恢復。如圖3所示，其肺結構功能趨于正常健康常氧幼鼠。說明高氧誘導的BPD 幼鼠給予靜脈注射BMSCs-VEGF 可以顯著地改善其肺泡結構異變。

2.4 BMSCs-VEGF可調節CD31、TGF-β、COLⅡ、COLⅤ蛋白的表達為研究BPD 幼鼠靜脈注射BMSCs-VEGF 后對其肺組織細胞增殖、肺內血管形成及肺纖維化的機制，Western bolt 方法檢測細胞增殖相關蛋白Ki67 的表達，結果顯示，注射BMSCs-VEGF 后，Ki67 蛋白水平顯著上調，趨于正常小鼠肺組織中Ki67 蛋白水平，如圖4所示。通過IHC檢測血管形成相關蛋白CD31 及纖維化相關蛋白TGF-β、COLⅡ、COLⅤ的表達。結果顯示，高氧組及VECTOR+高氧組相比于正常對照組，其血管形成相關蛋白CD31 表達極低，而纖維化相關蛋白TGF-β、COLⅡ、COLⅤ均顯著高表達。注射BMSCs-VEGF 后的高氧組，CD31 蛋白表達有所上升且與正常對照組表達相似，而TGF-β、COLⅡ、COLⅤ的表達均顯著下調，且與正常對照組相比，差異無統計學意義，這與已有研究一致［13］。

圖3 肺切片染色檢測肺泡重構（Masson Trichrome 染色，×400）Fig.3 Determination of alveolar remodeling by Masson′s trichrome staining（Masson Trishrome，×400）

3 討論

BPD 是一種肺泡和肺內血管發育受阻引起的持續性呼吸窘迫慢性肺部疾病，是小早產兒呼吸系統常見疾病，也是早產兒死亡的最主要原因［14］。BPD 常表現為：肺泡簡單化改變，減少異常肺泡微血管發育和早期肺的重塑［15］。本研究結果顯示給予BPD 模型幼鼠靜脈注射BMSCs-VEGF 可以有效阻止肺泡單一化，并遏制肺內血管減少，抑制無序異常的肺重塑，從而改善早產幼鼠支氣管肺發育不良。臨床上BPD 常見于早產兒呼吸窘迫及機械通氣后，存活者常有肺功能障礙［16］。在此期間，還將反復發生肺炎、肺不張、支氣管痙攣引起的一系列并發癥［16］。本研究提示，支氣管肺發育不良及恢復期間，若給予早產兒靜脈注射BMSCs-VEGF，或將緩解支氣管肺異常發育，降低肺炎等并發癥的產生。盡管隨著機械通氣等治療BPD水平的提高，使早產兒存活率顯著提高，但BPD 發生率依舊呈逐年增加趨勢，嚴重影響早產兒存活率和生存質量，給家庭和社會帶來巨大經濟負擔和損失［17］。

圖4 CD31、TGF-β、COLⅡ、COLⅤ在各組中的表達Fig.4 CD31、TGF-β、COLⅡ、COLⅤexpression in each group

動物和臨床試驗研究表明，干細胞療法可調節疾病標志物，并且可能在組織/器官再生中發揮有效作用［18］。BMSCs 已被證明可有效修復心臟和肺部疾病，如心肌梗死［19］、肺纖維化和肺損傷［20］。小鼠［10］和大鼠［21］或人臍帶血來源的BMSCs，以預防方式靜脈注射時［22］，已被證明可改善高氧誘導的BPD 嚙齒動物模型的肺結構。

本研究采用高氧誘導新生鼠BPD模型，符合早產兒BPD 的病理生理發生、發展過程［23］。75%高氧是目前研究動物高氧肺損傷常用的濃度，短期可造成慢性肺損傷，2 周給氧可導致BPD 發生［24］。本研究顯示，幼鼠吸氧2 周后，出現肺泡結構簡單化、肺內血管數目明顯減少、肺纖維化、肺泡化停滯單一等現象。有研究表明［1］肺發育過程中血管新生是肺泡分化所必需的，肺泡分化與血管擴張直接聯系，同步作用可形成有效的氣血屏障［25］。而早產且聯合治療可使肺泡和肺血管發育進程中斷，導致肺泡發育受阻、肺泡和毛細血管數量的減少，最終使氣血交換面積減少，VEGF 主要作用于血管形成早期，促進原始血管網形成［26］。本研究表明，給予高氧誘導BPD 模型幼鼠靜脈注射BMSCs-VEGF 后，可以明顯阻止肺內血管減少，且這種效應是通過阻止CD31 蛋白表達調控實現的。CHOU 等［27］研究發現，BPD 肺發育和纖維化伴隨VEGF 表達的減少。而對其給予人源MSCs 可以改善缺陷性肺泡化，增加肺血管密度，減少肺纖維化，同時伴隨VEGF 表達的上調。DAO 等［28］在BPD 小鼠左肺切除的模型中，給予VEGF 觀察，發現實質肺體積、肺泡體積擴大且肺泡數增加，進而促進小鼠肺發育。在BPD 早產兔模型中，研究者［29］通過羊水干細胞介導VEGF 治療，發現VEGF同樣可以減輕其肺損傷。此外，臨床病例對照研究發現［30］，BPD 早產兒VEGF 的表達水平相比健康正常幼兒是顯著增高的。本研究則通過給予高氧誘導BPD 模型幼鼠靜脈注射BMSCs-VEGF 后，發現肺組織結構得到良好改善，降低了幼鼠肺呼吸阻力。肺結構的改善是通過調控Ki67、CD31、TGF-β、COLⅡ、COLⅤ蛋白表達的分子機制來實現的，通過Ki67 蛋白表達顯著上調促進肺細胞增殖，阻止CD31 蛋白表達進而遏制血管形成，降低TGF-β、COLⅡ、COLⅤ蛋白表達從而降低肺纖維化，最終改善支氣管肺不良發育。從而證實，BMSCs-VEGF 治療可以有效改善高氧誘導BPD 幼鼠的肺部情況，BMSCs-VEGF 治療或可成為臨床治療BPD 早產兒新型有效手段。

本研究闡述了給予靜脈注射BMSCs-VEGF 對BPD 幼鼠肺功能的改善作用，而其具體機制需要在隨后的研究中進一步探索。此外，BMSCs 衍生的干預措施似乎是一種很有前途的治療手段，適用于BPD、肺動脈高壓和其他慢性肺部疾病［21］，應在未來的臨床試驗中進行調查。盡管本研究存在樣本量少的問題，但結果顯示過表達VEGF 對BPD 肺功能的保護作用，提示VEGF 有望成為治療BPD的候選藥物之一。