三陰性乳腺癌JMJD3和PTEN的表達與臨床病理特征的關系

徐小艷 王建君 閆琛 李川 楊金花

鄭州人民醫院病理科（鄭州450000）

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一種特殊的臨床病理類型，約占浸潤性乳腺癌的20%，臨床上具有侵襲性強、預后差的特點，其對內分泌和靶向治療均不敏感，缺乏有效的個體化治療方法［1-2］。三陰性乳腺癌預后相關分子指標成為研究的焦點。JMJD3 又稱賴氨酸去甲基化酶6B（lysine demethylase 6B，KDM6B），其異常表達與多種腫瘤的發生、發展密切相關，被認為是具有潛在應用價值的腫瘤評估指標之一。前期的研究結果表明JMJD3 在乳腺癌發生、發展中扮演重要角色，其在正常組織中高表達，浸潤性癌組織中低表達，但并未進一步觀察JMJD3 在三陰性乳腺癌中的表達特點。10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）基因被認為是一種與腫瘤發生關系密切的抑癌基因，與乳腺癌的發生、發展和預后密切相關。本研究旨在探討JMJD3 與PTEN在TNBC 中的表達及其與臨床病理特征和預后的關系，并分析二者的相關性，為TNBC 靶向治療提供新的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2013年1月至2015年12月在鄭州人民醫院乳腺外科行手術治療、術后經病理確診且病歷完整的患者作為研究對象。研究樣本為87 例三陰性乳腺癌和80 例非三陰性乳腺癌病理活檢標，選取距三陰性乳腺癌腫物1 cm 處相對應的癌旁組織作為對照。按照2012年WHO 乳腺癌組織病理分級分類法，對其進行分組。有完整5年隨訪資料的患者83 例，患者無病生存期從手術之日開始計算，終止日期為腫瘤復發日期或末次隨訪日。所有標本均經10%的甲醛固定，石蠟包埋，并經鄭州人民醫院病理科診斷確診。

1.2 主要試劑JMJD3 一抗兔抗人多克隆抗體公司購自Abcam，PTEN 一抗兔抗人單克隆抗體、二抗及二氨基聯苯胺（DAB）均為福州邁新公司。

1.3 免疫組織化學染色主要步驟如下：（1）石蠟組織切片、烤片、脫蠟并水化；（2）抗原修復；（3）一抗37 ℃孵育2 h；（4）二抗37 ℃孵育20～30 min；（5）DAB 顯色5～10 min；（6）脫水、透明和封片。用已知JMJD3 和PTEN 陽性的乳腺癌組織和PBS分別代替一抗作為陽性和空白對照。

1.4 免疫組化結果判斷根據染色強度和染色細胞所占百分比進行評分，半定量判定：低表達包括：（1）陰性即無陽性著色；（2）弱陽性（+或者++，細胞著色范圍＜30%）；高表達包括：（1）中等強度陽性（++，細胞著色范圍≥30%或者+++，細胞著色范圍＜50%）；（2）強陽性（+++，細胞著色范圍≥50%）。本研究中陽性表達率=高表達樣本量/總樣本含量，免疫組化的判讀有兩位高年資病理醫師采用雙盲法進行判讀。

1.5 統計學方法采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據處理與統計分析JMJD3 和PTEN 陽性表達率和病理因素的相關性采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 法，并以Log-rank 法檢驗。二者的相關性采用Spearman 相關分析，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 JMJD3和PTEN在癌旁組織、非三陰性乳腺癌、三陰性乳腺癌中的表達免疫組化顯示JMJD3 主要定位于細胞核，呈棕褐色，87 例三陰性乳腺癌JMJD3 的陽性表達率34.48%（30/87）明顯低于相對應癌旁組織74.71%（65/87）和非三陰性乳腺癌組織75.00%（60/80），差異有統計學意義（χ2=39.191，P＜0.001）。PTEN 主要定位于細胞漿，呈棕褐色，87 例三陰性乳腺癌中，PTEN 的陽性表達表達率40.23%（35/87）明顯低于相對應癌旁組織68.97%（60/87）和非三陰性乳腺癌組織72.50%（58/80），差異有統計學意義（χ2=22.329，P＜0.001）。JMJD3、PTEN 在非三陰性乳腺癌和癌旁組織中表達率基本相似，差異無統計學意義。見圖1，表1。

表1 癌旁組織、非三陰性乳腺癌、三陰性乳腺癌中JMJD3和PTEN 的表達Tab.1 Expression of JMJD3，and PTEN in adjacent tissues，TNBC and non TNBC 例（%）

圖1 JMJD3 和PTEN 在癌旁組織、非三陰性乳腺癌、三陰性乳腺癌中的表達，免疫組織化學（物鏡200×）Fig.1 Expression of JMJD3 and PTEN in paracancerous tissue，non three negative breast cancer and three negative breast cancer，immunohistochemistry（objective 200×）

2.2 JMJD3 和PTEN 分別與三陰性乳腺癌臨床病理特征的關系87 例三陰性乳腺癌中，JMJD3 與組織學分級有關，即JMJD3 在高分化中的表達率76.00%（19/25）高于中-低分化17.74%（11/62），差異有統計學意義（χ2=27.765，P＜0.001）；JMJD3 在有淋巴結轉移中13.33%（6/45）低于無淋巴結轉移57.14%（24/42），差異有統計學意義（χ2=18.455，P＜0.001）；JMJD3 與TNM 分期有關，其在TNMⅠ期、Ⅱ期組別66.67%（20/30）高于Ⅲ期、Ⅳ期組別17.54%（10/57），差異具有統計學意義（χ2=20.994，P＜0.001）。JMJD3 與乳腺癌患者年齡、腫瘤位置及腫瘤直徑均無關（均P＞0.05）。見表2。

87 例乳腺浸潤性導管癌中，PTEN 在高分化中的表達率76.00%（19/25）高于中-低分化25.81%（16/62），差異具有統計學意義（χ2=18.667，P＜0.001）；其在淋巴結有轉移組別中22.22%（10/45）低于無淋巴結轉移組別59.52%（25/42），差異有統計學意義（χ2=12.571，P＜0.001）；其在TNMⅠ期、Ⅱ期組別70.00%（21/30）高于Ⅲ期、Ⅳ期組別24.56%（14/57），差異有統計學意義（χ2=16.877，P＜0.001）。PTEN 與乳腺癌患者年齡、腫瘤位置和腫瘤直徑均無關（均P＞0.05）。見表2。

表2 三陰性乳腺癌組織中JMJD3和PTEN的表達與臨床病理參數特征的關系Tab.2 Relationship between expression of JMJD3 and PTEN with clinicopathological characteristics of TNBC

2.3 三陰性乳腺癌中JMJD3和PTEN的相關性87例三陰性乳腺癌組織中，JMJD3和PTEN同時高表達者23例（26.44%），同時低表達者45例（51.72%），僅JMJD3 表達高表達者7 例（8.05%），僅PTEN 表達高表達者12 例（13.79%）。采用Spearman 相關分析，結果顯示JMJD3 和PTEN 表達呈正相關，差異有統計學意義（R=0.539，P＜0.001）。見表3。

表3 三陰性乳腺癌中JMJD3 和PTEN 的相關分析Tab.3 Spearman analysis of JMJD3 and PTEN in TNBC

2.4 JMJD3 和PTEN 蛋白表達與乳腺癌患者無病生存期的關系83 例三陰性乳腺癌患者5年總體無病生存率為49.0%（19/83）。JMJD3蛋白高表達者的無病生存率86.7%（26/30）高于低表達者43.4%（23/53），經Log-rank 時序檢驗，兩組差異有統計學意義（χ2=18.832，P＜0.001）。PTEN 蛋白高表達者無病生存率82.9%（29/35）高于低表達者41.7%（20/48），經Log-rank 時序檢驗，兩組差異均有統計學意義（χ2=20.783，P＜0.001）。JMJD3 和PTEN 共同高表達、單一指標高表達、二者均低表達無病生存率依次下降分別為87.5%（21/24）、75%（12/16）、37.2%（15/43），經Log-rank 時序檢驗，三組差異均有統計學意義（χ2=28.933，P＜0.001）。見圖2。

3 討論

TNBC 是一組高度異質性的惡性腫瘤，其組織學特點是腫瘤細胞核異型性明顯，核分裂象易見，分化較差，大部分組織學級別高，具有侵襲性強、易復發和轉移等特點，對內分泌治療和靶向治療均不敏感，治療較其他類型的乳腺癌更為困難，僅有15%～20%的TNBC 患者對化療敏感［3］，5年生存率較低［4］。因此，TNBC 患者迫切需要新的治療方法來改善預后，對三陰性乳腺癌相關分子研究引起越來越多的重視。

圖2 JMJD3 和PTEN 蛋白的表達與三陰性乳腺癌患者無病生存期的關系Fig.2 Expression of JMJD3 and PTEN protein and disease-free survival of triple negative breast cancer patients

JMJD3 編碼基因位于人類第17 號染色體上。研究發現，JMJD3 作為一種賴氨酸27 位點三甲基化組蛋白H3 去甲基化酶（histone H3 methylated Lys27，H3K27me3），其異常表達與多種腫瘤的發生、發展及預后密切相關［5-6］，JMJD3 在腫瘤發生發展過程中扮演促癌基因或者抑癌基因角色，報道不一。國內有研究表明［7］JMJD3 表達降低可能促進肺癌的發生發展。在胃癌中JMJD3 低表達對胃癌細胞的增殖具有抑制作用，對細胞凋亡具有促進作用［8］。上述研究均表明JMJD3 在腫瘤中扮演抑癌基因角色。但是，部分研究表明JMJD3 在腫瘤中扮演促癌基因角色，研究發現［9］膠質母細胞瘤中JMJD3 表達高于正常腦組織，JMJD3 抑制劑能夠誘導膠質瘤細胞凋亡，抑制細胞遷移。張陪陪［10］研究表明在肝癌細胞中轉染入JMJD3 的干擾質粒后，肝癌細胞的生長、增殖、侵襲能力均降低。

有關JMJD3 在乳腺癌組織中表達規律的研究，前期研究［11］結果顯示JMJD3 在乳腺浸潤性導管癌組織表達水平較癌旁組織低，JMJD3 蛋白在組織學分化差、淋巴結轉移及較高TNM 分期中表達率減低，JMJD3 在乳腺癌中扮演了抑癌基因的角色，其在三陰性乳腺癌表達減低，但是前期研究尚未進一步觀察JMJD3 在三陰性乳腺癌中表達與臨床病理特征和預后的關系。本研究結果表明JMJD3 在三陰性乳腺癌表達減低，其在乳腺癌旁組織和非三陰性乳腺癌中表達較高。JMJD3 在三陰性乳腺癌組織學分化差、淋巴結有轉移及TNM分期Ⅲ、Ⅳ期表達減低，其表達越低，患者無病生存期越短。有研究表明JMJD3 家族去甲基化酶是通過參與性激素受體的信號轉導來發揮其生理功能的，在女性乳腺癌細胞中JMJD3 表達明顯增加［12］，這也能夠解釋在三陰性乳腺癌中JMJD3 表達減低的原因。本研究結果顯示腫物直徑越大，JMJD3 表達率越低，但差異卻無統計學意義，可能跟研究樣本量有關。

PTEN 是一種重要的抑癌基因，表達一種膜結合型脂質磷酸酶，能催化三磷酸磷脂酰肌醇去磷酸化，進而拮抗PI3K，最終抑制細胞生長并介導細胞凋亡［13］。目前已在多種腫瘤中發現存在PTEN基因的突變，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等［14-16］，它能夠負性調節細胞生長，誘導凋亡并抑制細胞浸潤和轉移［17-18］。本研究結果表明，三陰性乳腺癌組織中PTEN 蛋白的陽性表達率低于乳腺癌旁組織和非三陰性乳腺癌組織，其表達與乳腺癌的組織學分級、淋巴結轉移、TNM 分期和預后有關，而PTEN 蛋白的表達與其他臨床病理特征包括年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑均無關。以往文獻［19］報道，PTEN 蛋白在三陰性乳腺癌中低表達，其表達與臨床分期及淋巴結轉移密切相關，而與組織學分級無關。筆者推測其原因如下：（1）跟樣本含量有關；（2）免疫組織化學染色結果判讀標準不同。孫志微等［20］研究表明PTEN 抑癌基因可通過抑制三陰性乳腺癌細胞FAK 磷酸化，抑制腫瘤細胞復制，進而抑制乳腺癌細胞增殖及侵襲。PTEN 在三陰性乳腺癌中的具體作用機制尚需進一步研究。

本研究結果表明，JMJD3 和PTEN 在三陰性乳腺癌中表達均減低，扮演抑癌基因角色，二者均低表達患者預后更差，相關分析結果顯示二者呈明顯正相關關系，在三陰性乳腺癌的發生發展中可能存在協同作用。有關二者的相關性，國內外尚未見同類文獻報道。值得注意的是，有研究表明JMJD3 能夠通過NF-κB 信號通路調節腫瘤微環境，促進黑色素瘤的進展和轉移［21］，NF-κB 信號轉導通過miR-181a/PTEN 軸促進大腸癌細胞生長［22］，在結腸癌中PTEN 能夠通過PI3K/AKT/NF-kB 途徑抑制結腸癌的進展［23］。由此可見JMJD3 和PTEN涉及共同的信號通路，二者在三陰性乳腺癌中具體作用機制可以作為后續的進一步研究方向。

綜上所述，JMJD3 和PTEN 的異常表達與三陰性乳腺癌的發生、發展密切相關，二者可能存在相關調控機制，本研究不僅為相關信號通路機制研究提供依據，而且提示對三陰性乳腺癌JMJD3 和PTEN 的檢測有助于判斷疾病的進展和預后，為尋找三陰性乳腺癌治療靶標提供新的方向。